Программа спецкурса «Транспорт веществ через биологические мембраны в норме и патологии»

Лекторы - А. М. Рубцов и О. Д. Лопина

Особенности строения клеток прокариот и представителей разных царств эукариот. Фософолипиды, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды: структура и физико-химические свойства. Фосфолипидные мицеллы, липосомы и бислои. Биологические мембраны. Асимметрия мембран. Липидные кластеры. Подвижность липидов в мембранах, холестерин. Латеральная диффузия липидов. Фософолипазы, десатуразы и другие ферменты, участвующие в изменении свойств мембран.

Мембранные белки: трансмембранные домены на основе альфа-спиралей и бета-складок. Способы заякоривания периферических белков в мембранах. Атомно-силовая микроскопия и радиоинактивация в исследовании мембранных белков. Криоэлектронаня микроскопия. Индексы гидропатии и предсказание вторичной структуры мембранных белков. Рентгеноструктурный анализ.

Диффузия низкомолекулярных соединений через мембраны. Коэффициент проницаемости и скорость диффузии. Пассивный и активный транспорт веществ через мембраны. Классификация переносчиков, каналов и насосов. Ионный состав цитоплазмы и внутренней среды организма. Трансмембранный потенциал и причины его возникновения. Разделение зарядов на мембране. Уравнение Нернста и Доннановское равновесие.

Методы и объекты, используемые для изучения транспортных процессов. Получение изолированных клеток из различных тканей. Клетки животных в культуре, трансформация культивируемых клеток. Тени эритроцитов. Получение замкнутых везикул методом дифференциального центрифугирования, очистка везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Маркеры биологических мембран. Ориентация мембран в везикулах (right-side out и inside out).

Плоские липидные мембраны и липосомы. Классические и обращенные мицеллы. однослойные, малые и крупные многослойные липосомы. Липосомы с встроенными транспортными белками. Ингибирование транспорта в липосомах малых размеров. Ионофоры: валиномицин, нигерицин, монензин, А-23187. Каналообразователи: грамицидин, аламетицин. регистрация транспорта: изотопный метод, оптический метод, регистрация АТРазной активности, токи через плоскую мембрану со встроенным переносчиком, пэтч-клэмп техника.

Принципы пассивного и вторично-активного переноса веществ через мембраны. Переносчики суперсемейства MFS, особенности их структуры и механизм функционирования. Способы анализа аминокислотной последовательности мембранных белков и предсказания их вторичной структуры.

Классификация транспортных АТРаз, их характерные свойства, внутриклеточная локализация, функции. Эволюция АТРаз P-типа. Na,K-АТРаза как представитель гетеродимерных АТРаз Р-типа. Открытие Na,K-АТРазы и ее идентификация как Na-насоса. Частные реакции, осуществляемые Na,K-АТРазой, потоки ионов через Na,K-АТРазу, стехиометрия транспорта в различных условиях. Доказательство существования Е1 и Е2 конформаций. Окклюдированные формы. Схема транспорта и состояние каналов в различных конформациях. Распространение Na,K-АТРазы и ее очистка. Структура Na,K-АТРазы: субъединицы, их упаковка в мембране. Изоформы альфа- и бета-субъединиц Na,K-АТРазы, их распространение и функции. Нуклеотид-связывающий, фосфорилируемый, активаторный и трансмембранные домены Na,K-АТРазы. Трансмембранные фрагменты (19 кДа фрагмент) и их функция. Третичная и четвертичная структура Na,K-АТРазы. Конформационные переходы в молекуле Na,K-АТРазы.

Функции Na,K-насоса в различных тканях: обеспечение поддержания потенциала покоя и потенциала действия, транспорт сахаров и аминокислот, Na/Са- и Na/Н-антипортеры. Положительный инотропный эффект. Участие Na,K-насоса и других транспортеров в поддержании внутриклеточного рН. Участие Na,K-насоса в трансэпителиальном транспорте ионов и малых молекул. Неравномерное распределение Na,K-АТРазы в плазматической мембране поляризованных клеток и участие анкирина в этом процессе. Долговременная и кратковременная регуляция активности Na,K-АТРазы. Регуляция реабсорбции в нефроне. Фосфорилирование Na,K-АТРазы различными протеинкиназами и физиологическое значение этого явления. Роль Na,K-насоса в регуляции объема клетки. Na,K-АТРаза как рецептор для стероидных гормонов. Гены, экспрессия которых запускается ингибированием Na,K-АТРазы. Механизмы, обеспечивающие ответ кардиомиоцитов на связывание уабаина с Na,K-АТРазой. Уабаин и некроз эпителия, возможные механизмы. Роль эндогенных уабаин-подобных соединений в развитии гипертонической болезни.

Системы, обеспечивающие секрецию соляной кислоты париетальными клетками в желудке. Структура Н,К-АТРазы, механизмы активации секреции соляной кислоты. Блокаторы Н2-рецепторов и их действие на секрецию. Семейство необратимых ингибиторов Н,К-АТРазы, механизм их действия на насос. Сравнение свойств различных ингибиторов и их эффектов на Н,К-АТРазу.

Са-АТРаза саркоплазматического ретикулума и ее изоформы. Реакционный цикл Са-АТРазы. Структура молекулы Са-АТРазы и конформационные изменения трансмембранного и цитоплазматического доменов молекулы фермента в процессе функционирования. Особенности кинетики Са-АТРазы. Олигомерная организация фермента. Белки-регуляторы Са-насоса фосфоламбан и сарколипин. Болезни человека, связанные с нарушением обмена Са2+. Са-АТФаза плазматических мембран.

АВС-суперсемейство АТРаз и множественная устойчивость к лекарствам. АВС-АТРазы прокариот и эукариот. MDR1 человека, его структура и механизм работы. Структура генов представителей семейства АВС. Бактериальные флиппазы и пермеазы. Участие периплазматических субстрат-связывающих белков в работе пермеаз. TolC – бактериальный белок, обеспечивающий перенос различных соединений через периплазматическое пространство. Участие белков суперсемейства MFS в лекарственной устойчивости бактерий.

АТРазы V-типа: молекулярная организация и функционирование в сравнении с АТРазами F-типа. Локализация АТРаз V-типа во внутриклеточных мембранах (эндосомы и лизосомы) и в плазматической мембране клеток животных. Роль в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте, в проникновении в клетку бактерий и вирусов, в процессинге секретируемых белков и обратном транспорте в синаптосомах. Функции АТРаз V-типа в плазматической мембране остеокластов, макрофагов, интеркалярных клетках почечного эпителия и сенсорных клетках кортиевого органа, в процессе метастазирования опухолей. Регуляция активности путем диссоциации V1-домена, связывания белков Ravе, за счет изменения потенциала на мембране и путем образования внутренних дисульфидных связей.

Н-АТРаза растений, ее роль в поглощении солей корнями растений, регуляция активности за счет аутоингибиторного домена. АТРаза – транспортер ионов Cu как пример АТРаз I подтипа, Cu-АТРаза человека и металлошаперон Atox-1: регуляция функции. Болезнь Вильсона-Коновалова. Белки семейства FXYD, гамма-субъединица Na,K-ATPазы, фосфолеман и CHIF как представители семейства, их функции в реабсобции Na+ в почках. Эволюция АТРаз P-типа.

Ионные каналы, их классификация, особенности структуры. Ионные радиусы и размеры пор ионных каналов. Ионная селективность и механизм работы селективных фильтров. Селективный фильтр, пора и калитка ионных каналов. Принципы работы калитки. Моделирование гидрофильных и гидрофобных калиток в мембранах («нанопоры»). Представители каналов с гидрофобными и гидрофильными калитками. Лиганд-управляемые ионные каналы, их основные классы. Ацетилхолиновый рецептор: особенности структуры и функционирования. Хлорные каналы (глициновые рецепторы).

Потенциал-чувствительные ионные каналы. Особенности структурной организации потенциал-чувствительных К+-, Na+- и Са2+-каналов. Методы регистрации одиночных каналов. Параметры работы ионных каналов, определяемые в электрофизиологических экспериментах. Потенциал действия. К+-канал дрозофилы Shaker и особенности его работы. Понятие об ион-селективном фильтре канала и принципе его работы. Ион-селективные фильтры К+-каналов. Калитка (ворота) канала и управление ее работой. Конформационные переходы и управление работой калитки. Работа «сенсора напряжения» потенциал-чувствительных каналов. Регуляция открывания и закрывания калитки.

Каналы, управляемые внутриклеточными сигналами. Участие цГМФ-активируемых каналов в фоторецепции. Предполагаемая структура цГМФ-управляемого канала. Участие цАМФ-активируемых Са-каналов и Са-активируемых Сl-каналов в работе обонятельных рецепторов. Участие РКА-регулируемых К-каналов во вкусовой рецепции. Каналы, управляемые метаболитами липидного обмена. Участие TRP/TRPL-каналов в работе фоторецепторов насекомых.

Роль кальция как вторичного посредника в разных типах клеток и Са-зависимые регуляторные пути. Потенциал-чувствительные Са-каналы плазматической мембраны, их типы и принципы классификации. Субъединичная структура Са-каналов, роль субъединиц, принципы их взаимодействия. Регуляция работы Са-каналов протеинкиназами и цитоплазматическими регуляторными белками (G-белки и белки SNARE). Мутантные формы альфа1-субъединицы Са-каналов P/Q-типа и развитие нейродегенеративных заболеваний (наследственные формы мигрени, мозжечковая и эпизодическая атаксия). Дигидропиридиновые рецепторы и рианодиновые рецепторы. История открытия и идентификации. Роль в электромеханическом сопряжении.

Са-каналы (рианодиновые рецепторы) и Са-АТРаза сарко(эндо)-плазматического ретикулума: молекулярная организация и особенности регуляции. Мембранные ион-транспортирующие системы, участвующие в обмене кальция в разных типах клеток. Структура мышечного волокна и белковый состав мембран саркоплазматического ретикулума: тяжелая и легкая фракции СР. Белки «соединительных ножек» и рианодиновые рецепторы: идентификация и очистка. Структура рианодинового рецептора. Изоформы рианодинового рецептора, экспрессирующиеся в разных тканях. Активаторы и ингибиторы рианодиновых рецепторов. Криоэлектронная микроскопия. Особенности структурной организации триад в скелетных мышцах и диад в миокарде.

Взаимодействие рианодиновых и дигидропиридиновых рецепторов. Белки-регуляторы рианодиновых рецепторов. Роль Са-связывающих белков (кальмодулин, кальсеквестрин, саркалюменин) в регуляции функциональной активности Са-каналов ретикулума. Механизм электромеханического сропряжения в скелетной и сердечной мышцах. Циклическая АДФ-рибоза как основной активатор Са-каналов в гладких мышцах и немышечных тканях. Регуляция сердечной изоформы рианодинового рецептора протеинкиназой А и сердечная недостаточность. Конфокальная микроскопия и регистрация Са-спарков. Злокачественная гипертермия и Central Core Desease. Нагревательный орган рыб, участие Са-каналов и Са-АТРазы ретикулума в термогенезе.

Рецепторы инозитолтрифосфата. Фосфатидилинозитол как предшественник вторичных посредников. Структура IP3-рецепторов. Функциональные домены IP3-рецепторов. Сходство и различие IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Регуляция IP3-рецепторов кальмодулином. Участие IP3-рецепторов в Са-индуцируемом выбросе Са2+ и формировании Са-волны. Возможный механизм заполнения кальцием внутриклеточных депо и участие в этом процессе IP3-рецепторов. Белок Homer и формирование кластеров рецепторов плазматических мембран и внутриклеточных органелл. «Са-осцилляторы» и совместная работа IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Внутриклеточные посредники cADPR и NAADP.

Переносчик глюкозы GLUT1, его структура и основные кинетические свойства. Анализ олигомерной организации мембранных белков и способы исследования их локализации в мембране (Cys-мутагенез). Амфипатические альфа-спирали и формирование гидрофильных полостей в мембране. Семейство переносчиков GLUT-HMIT, распространение, кинетические характеристики, функции в разных тканях, особенности структуры (sugar/polyol transporter signature). Переносчики SGLT и транспорт глюкозы через эпителий в тонком кишечнике и почках. Заболевания, связанные с нарушением работы переносчиков глюкозы, и способы их коррекции. Нарушение поглощения глюкозы и галактозы в кишечнике. Конвульсивные состояния новорожденных и синдром De Vivo. Синдром Фанкони-Бискела. Механизм стимуляции инсулином поглощения глюкозы в скелетных мышцах, сердце, жировой ткани и диабет II типа. АТФ-управляемые К-каналы и инсулинопатии.

Фосфатидилинозитол как предшественник ряда вторичных посредников. IP3-киназа. Два пути стимуляции инсулином встраивания везикул, содержащих переносчик GLUT4, в плазматическую мембрану. Структура переносчика лактозы LacY и особенности его функционирования. Антипортеры и симпортеры. Na/Ca-обменник, его структура и физиологическая роль. Участие НСО3/Сl-антипортера (белок АЕ1, белок полосы III) в транспорте СО2 эритроцитами. Зависимость активности основных мембранных переносчиков, регулирующих внутриклеточный рН, от значения рН цитоплазмы. Участие ионных насосов, антипортеров и каналов в секреции соляной кислоты париетальными клетками желудочных желез. Участие антипортеров и каналов в накоплении солей и сахарозы вакуолями растительных клеток.

Порины. Доказательства существования аквапоринов. Структуры воды и водородные связи. Молекулярная структура канала. Аквопорин как канал без калитки. свойства канала, обеспечивающие проведение воды, но не ионов (включая Н+): селективнй фильтр, электростатичское отталкивание Н+, образование водородных связей с каналом. Разнообразие аквапоринов человека, аквапорины прокариот и растений. Заболевания человека, обеспечиваемые мутациями в аквапоринах (наследственная катаракта, несахарный диабет, сердечная недостаточность, ишемические поражения и водянка мозга, отравления арсенатом).


Литература:

  1. Lodish H., Berk A., Zipurski S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. Molecular Cell Biology. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2001.
  2. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. Garland Science. 2002.
  3. Nelson D.L., Cox M.M. Leninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2005.
  4. Carterall W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. v. 16, p. 521-555.
  5. MacKinnon R.M. Potassium channels. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 62-65.
  6. Urwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS Lett. 2003. v. 555, pp. 91-95.
  7. Cancela M.J. Specific Ca2+ signaling evoked by cholecystokinin and acethylcholine: the roles of NAADP, cADPR, and IP3. Ann. Rev. Physiol. 2001. v. 63, pp. 99-117.
  8. Matulef K., Zagotta W.N. Cyclic nucleotide gated ion channels. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. v. 19, pp. 23-44.
  9. Hardie R.C. Regulation of TRP channls via lipid second messengers. Ann. Rev. Physiol. 2003. v. 65, pp. 735-759.
  10. Brown G.K. Glucose transporters: structure, function and consequences of deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 2000. v. 23, pp. 237-246.
  11. Hruz P.W., Mueckler M.M. Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter. Molec. Membr. Biol. 2001. v. 18, pp. 183-193.
  12. Wood I.S., Trayhurm P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded families of sugar transport proteins. Br. J. Nutr. 2003. v. 89, pp. 3-9.
  13. Moller J.V., Juul B., le Maire M. Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 1996. v. 1286, pp. 1-51.
  14. Lopina O.D. Na,K-ATPase: structure, mrchanism, and regulation. Membr. Cell Biol. 2000. v. 13, pp. 721-744.
  15. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1389-1400.
  16. Toyoshima C., Inesi G. Structural basis of ion pumping by Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 2004. v. 73, pp. 269-292.
  17. Лопина О.Д., Рубцов А.М. Н,К-АТРаза и регуляция секреции НСl слизистой оболочкой желудка. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1235-1242.
  18. Thomas U. Modulation of synaptic signalling complexes by Homer protein. J. Neurochem. 2002. v. 81, pp. 407-413.
  19. Рубцов А.М., Батрукова М.А. Кальцтевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1091-1105.
  20. Ogawa Y., Kurebayashi N., Murayama T. Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 1999. v. 36, pp. 27-64.
  21. Рубцов А.М. Молекулярные механизмы регуляции активности Са-каналов сарокплазматического ретикулума, утомление мышц и феномен Северина. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1401-1414.
  22. MacLennan D.H. Ca2+ signalling and muscle disease. Eur. J. Biochem. 2000. v. 267, pp. 5291-5297.
  23. Theodoulou F.L. Plant ABC transporters. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 79-103.
  24. Chang G. Multidrug resistance ABC transporters. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 102-105.
  25. Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 17-36.
  26. Nishi T., Forgac M. The vacuolar (H+)-ATPases – nature’s most versatile proton pumps. Nature Rev., 2002. v. 3, pp. 94-103.
  27. Pedersen P.L. Transport ATPases in biology systems and relationship to human disease: a brief overview. J. Bioenerg. Biomembr. 2002. v. 34, pp. 327-332.
  28. Borgnia M., Nielsen S., Engel A., Arge P. Cellular and molecular biology of aquaporin water channels. Annu. Rev. Biochem. 1999. v. 68, pp. 425-458.
  29. Arge P., Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 72-78.
  30. Gonzalez M.E., Carrasco L. Viroporins. FEBS Lett. 2003. v. 552, pp. 28-34.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010