Программа спецкурса "Электрофоретические и хроматографические методы исследования макромолекул"

Электрофоретические методы исследования

Лектор - Н.Б. Гусев

Классификация различных электрофоретических методов разделения макромолекул (аналитические и препаративные методы разделения в электрическом поле, электрофорез со свободной границей, зональный электрофорез, вытеснительные методы электрофореза). Перемещение частиц в электрическом поле. Зависимость скорости перемещения от напряженности электрического поля, заряда частицы и силы трения, препятствующей движению заряженной частицы. Влияние ионной силы на перемещение частиц в электрическом поле. Зависимость скорости перемещения заряженной частицы от ее молекулярной массы и формы.

Электрофорез с подвижной границей. Электрофоретический аппарат Тизелиуса и современные жидкостные сортировщики клеток. Различные виды зонального электрофореза. Бумажный электрофорез и разделение аминокислот и пептидов. Зависимость электрофоретической подвижности аминокислот от рК и рН. Условия разделения аминокислот и пептидов на бумаге. Используемые буферы и приборное оснащение. Электрофоретическое разделение мононуклеотидов на бумаге. Методы детекции аминокислот, пептидов и нуклеотидов при электрофорезе на бумаге. Электрофорез на нитроцеллюлозе.

Электрофорез в крахмале, агарозе и полиакриламидном геле. Достоинства полиакриламидного геля. Строение и свойства акриламида, метиленбисакриламида, инициаторов и катализаторов полимеризации. Полимеризация с использованием персульфата аммония и рибофлавина. Зависимость пористости геля от концентрации мономера и «сшивки». Механические и оптические свойства полиакриламидных гелей. Использование окислителей и восстановителей и специальных видов «сшивок» для деполимеризации гелей. Уравнение Фергюссона и его использование для определения молекулярной массы белков и их олигомерного состава. Гомогенные и гетерогенные (прерывистые) буферные системы, используемые для электрофоретического разделения белков. Диск электрофорез при щелочных и кислых значениях рН. Использование ионных детергентов для электрофоретического определения молекулярной массы белков и пептидов. Додецилсульфат натрия и цетилтриметиламмоний бромид и их использование для определения кажущейся молекулярной массы белков. Факторы, влияющие на определение молекулярной массы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, возможные артефакты и пути их преодоления. Сопоставление различных способов определения молекулярной массы белков с помощью электрофореза.

Способы детекции белков в полиакриламидном геле (окрашивание анионными красителями Кумасси и амидовый черный, окрашивание универсальным красителем stains-all, осаждение кислотами, окрашивание серебром). Способы электропереноса белков и пептидов на нитроцеллюлозные фильтры. «Сухие» и «влажные» блоттеры, состав буферных растворов, используемых для электропереноса. Детекция белков на нитроцеллюлозной мембране (красители, авидин-биотиновый метод, «окрашивание» антителами, окрашивание коллоидным золотом, использование радиоактивных изотопов для детекции катион-связывающих белков). Секвенирование белков, перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры.

Капиллярный электрофорез. Приборное оснащение, влияние электроэндоосмоса. Различные варианты капиллярного электрофореза (зональный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, использование изоэлектрофокусирования и изотахофореза в капиллярном электрофореза).

Использование методов электофореза для решения современных задач протеомики. Одно- и двумерное электрофоретическое разделение белков. Элюция белков с геля и определение их молекулярной массы с помощью методов масс-спектроскопии. Различные виды масс-спектроскопии (MALDI и электроспрей). Гидролиз белков в геле и разделение полученных пептидов методами масс-спектроскопии. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектроскопия. Тандемная масс-спектроскопия и определение частичной или полной первичной структуры неизвестных белков. Изучение экспрессии различных белков на разных этапах жизнедеятельности клетки. Особенности электрофореза нуклеиновых кислот (размер молекул, постоянство соотношения заряд/масса, высокая гибкость, наличие вторичной структуры). Пульсовый электрофорез. Разделение нуклеиновых кислот в агарозе. Электрофорез олигонуклеотидов в полиакриламидном геле. Принципы секвенирования нуклеиновых кислот. Эффективность определения первичной структуры белка по структуре гена.

Изоэлектрофокусировние как один из методов вытеснительного электрофореза. Искусственные градиенты рН (градиенты рН, создаваемые с помощью градиента температуры или с помощью градиента неэлектролитов). Структура амфолинов и их свойства. Требования, предъявляемые к амфолинам. Препаративное и аналитическое изоэлектрофокусирование, носители, используемые при проведении опытов по изоэлектрофокусированию. Роль электроэндоосмоса и катодный дрейф. Особенности окрашивания гелей после проведение изоэлектофокусирования. Иммобилины и электофокусирование на гелях с иммобизованным градиентом рН.

Изотахофорез. Принципы метода и его разрешающая способность. Управляющее уравнение Кольрауша и соотношение концентрации исследуемых веществ в разделяемых зонах. Техническое оснащение метода изотахофореза. Использование амфолинов для разделения зон веществ, фракционируемых при изотахофорезе. Разрешающая способность изотахофореза и сравнение процессов, происходящих при изотахофорезе, с процессами, происходящими при диск-электрофорезе.

Литература

  1. Уильямс В., Уильямс X. Физическая химия для биологов. М. Мир, 1976
  2. Маурер Г. Диск-электрофорез. М. Мир, 1971.
  3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкей Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М. Мир, 1982
  4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М. Наука, 1981
  5. Остерман Л.А. Методы исследования биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М. Наука, 1983
  6. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. М. Мир, 1986
  7. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов. Сб. под ред. В.Т. Иванова М.Наука, 1992.

Хроматографические методы исследования

Лектор – М.И. Сафронова

Определение понятия «хроматография». Универсальность этого метода применительно к разделению и идентификации самых разных классов соединений органической и неорганической природы. Использование хроматографии в науке, технике и производстве. Развитие метода «хроматография». Значение хроматографического метода в становлении современных экспериментальных дисциплин таких, как биологическая химия, молекулярная биология, биоорганическая химия и др. Успехи, достигнутые с использованием этого метода.

Подвижные и неподвижные фазы в хроматографических системах. Явления, происходящие при движении веществ по хроматограмме. Классификация хроматографических методов. Коэффициент Нернста. Изотермы адсорбции. Основное уравнение хроматографии.

Основные положения теории хроматографии. Понятие «время удерживания», «объем удерживания», «исправленные время и объем удерживания». Коэффициент разделения. Эффективность, селективность и коэффициент емкости хроматографической системы. Использование теоретических предпосылок метода в практической деятельности.

Адсорбционная хроматография. Природа взаимодействия разделяемых соединений с адсорбентами. Требования, предъявляемые к сорбентам адсорбционной хроматографии. Полярные и неполярные адсорбенты. Размер образца и линейная емкость адсорбента. Активные центры и дезактивация адсорбентов. Полярность элюирующих систем. Энергия адсорбции элюирующих систем. Элюотропные ряды. Характеристика особенностей адсорбируемых соединений. Величины энергии адсорбции разделяемых соединений. Эволюция адсорбентов и адсорбционной хроматографии.

Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и ее особенности. Современное состояние этого вида хроматографии. Достоинства и недостатки ВЭЖХ.

Распределительная жидкостная хроматография. Распределение соединений между двумя несмешивающимися фазами. Разделение благодаря характеристике полярности разделяемых молекул. Подвижные и неподвижные жидкие фазы. Инертные носители.Их гидрофильность и гидрофобность. Характеристика жидкостей, используемых в качестве подвижной и неподвижной фазы в распределительной хроматографии. Нормальная и обратнофазная распределительная хроматография. Варианты распределительной хроматографии: колонки, тонкослойная хроматография, хроматография на бумаге. Достоинства и недостатки распределительной хроматографии.

Газовая хроматография. Газоадсорбционная и газораспределительная хроматографии, их характеристика. Особенности жидкостей и газов в газовой хроматографии. Устройство газового хроматографа. Колонуи и детекторы, используемые в газовой хроматографии. Достоинства этого вида хроматографии и преимущества перед жидкостной хроматографией.

Гельхроматография. Принцип метода. Параметры, характеризующие положение веществ при этом виде хроматографии: VT, V0, Vi, Vm, Ve, Vs, Kav. Природа и структура гелей в гельхроматографии, гели на основе декстрана, агарозы, полиакриламида и др. Комбинированные гели и их концентрация. Кривые селективности. Подсчет возможного числа разделяемых фракций в хроматографической системе. Объем вносимых образцов и их концентрация. Скорость тока жидкости в хроматографической системе при гельхроматографии. Высота и диаметр колонок с носителями. Хранение гелей. Задачи, решаемые гельхроматографией.

Ионообменная хроматография. Принцип метода. Характеристика ионитов. Сильные и слабые иониты. Структура матриц ионитов, используемых для разделения низкомолекулярных соединений. Редко и плотно сшитые иониты. Обменная емкость ионитов. Маркировка ионитов. Механизм ионного обмена. Зависимость константы скорости обмена от величины заряда и радиуса хроматографируемых соединений. Условия десорбции в ионообменной хроматографии. Градиентная элюция. Типы градиентов. Задачи, решаемые ионообменной хроматографией. Разделение аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Особенности фракционирования белков методом ионообменной хроматографии. Природа ионитов, их строение. Иониты на основе целлюлозы, декстрана, агарозы и др. Их сходство и различия. Функциональные группы ионитов, используемых для разделения белков. Зависимость зарядов ионитов от рН среды. Зависимость знака и величины заряда белка от рН среды. Особенности сорбции белков на ионитах. Зона стабильности белка. Выбор ионита (сильный-слабый, катионит-анионит). Количество ионита. Буферные растворы, используемые в ионообменной хроматографии белков. рН, ионная сила и природа буфера.

Литература

  1. Э. Дейл, К. Мацек, Я. Янек (ред.) «Жидкостная колоночная хроматография». М. Мир, 1978 (тт. 1-3)
  2. О. Микеш (ред.) «Лабораторное руководство по хроатографическим и смежным методам». М. Мир, 1982 (тт. 1, 2)
  3. Р. Скоупс. «Методы очистки белков». М. Мир, 1985
  4. X. Д. Якубке, X. Ешкайт. «Аминокислоты, пептиды и белки». М. Мир, 1985
  5. Л. А. Остерман «Хроматография белков и нуклеиновых кислот». Наука, 1985
  6. Э. Хэфтман «Хроматография. Практическое приложение метода». М., Мир, 1986 (тт. 1, 2)
  7. А. Дабре (ред.). «Практическая химия белка» М., Мир, 1989
  8. В. М. Липкин (ред.) «Проблемы белка», т. 1. «Химическое строение белка». М., наука, 1995
  9. К. Геккелер, X. Экштайн. «Аналитические и препаративные лабораторные методы». М., Химия, 1994
  10. А. Хенеш, К. Хупе и др. (ред.) «Высокоэффективная жидкостная хроматография». М., Мир, 1988
  11. А. Нидервайзе, Г. Патаки «Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков». М., Мир, 1974
  12. Г. Берифильд, Сторрс «Газовая хроматография в биохимии». М., Мир, 1964
  13. Ю. Кирхнер. «Тонкослойная хроматография». М., Мир, 1981 (тт. 1, 2)
  14. «Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов» (ред. В. Т. Иванов) М., Наука, 1992

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010