Программа курса "Биоиженерия"

Лектор - член-корр. РАН С.А. Лукьянов


Современная концепция гена. Структурные элементы гена. Модули, контролирующие транскрипцию, в эукариотических генах, кодирующих белки. Понятие о коровом промоторе, энхансерах, сайленсерах, инсуляторах и проксимальной промоторной области. Центральная догма молекулярной биологии. Пост-транскрипционная модификация РНК. Альтернативный сплайсинг.

Сложность генома. Размеры геномов. Определение термина «Геном», «Генотип» и «Фенотип». Корреляция между размером эукариоического генома и биологической сложностью видов. Повторяющиеся элементы в геноме. Подходы к изучению генов, белков и геномов.

Эндонуклеазы рестрикции. Эндонуклеазы рестрикции II типа, их номенклатура и субстратная специфичность. Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз II типа.

Отбор клонов из библиотек ДНК. Использование изотопов для мечения нуклеотидов. Приготовление гибридизационных зондов (ник-трансляция, амплификация со случайного праймера, достраивание концов с помощью фрагмента Кленова).

Понятие о векторе. Основные компоненты вектора. Использование бактериальных плазмид в качестве векторов. Полилинкер. Бело-голубая селекция. Введение чужеродной ДНК в клетку: химическая трансформация и электропорация.

ДНК лигазы. Лигирование фрагментов ДНК. Продукты лигирования вектора и вставки. Использование щелочной фосфатазы и полинуклеотидкиназы при лигировании. Создание сайтов рестрикции на концах молекул ДНК с помощью линкеров, адапторов и ПЦР.

Векторы на основе хромосомы фага λ. Космиды и их емкость. Использование космид и векторов на основе хромосомы фага λ. Искусственные хромосомы BAC и YAC. Их емкость и применение. Приготовление библиотеки геномной ДНК. Виды геномных библиотек. Репрезентативность библиотеки ДНК. Упорядоченные библиотеки ДНК.

Секвенирование ДНК по методу Сэнгера. Дидезоксинуклеотиды. Ферменты, используемые для секвенирования по методу Сэнгера. Стратегия секвенирования больших геномов методом shotgun.

Полимеразная цепная реакция. Основные компоненты ПЦР. Типичная программа ПЦР. Температура отжига праймеров. Влияние различных компонентов на эффективность ПЦР. Контроли, используемые при постановке ПЦР. Основные проблемы, возникающие при постановке ПЦР.

Термостабильные ДНК полимеразы. Специфичность ПЦР: ПЦР с «горячим стартом», Nested PCR, Step-out PCR. Амплификация длинных фрагментов ДНК с использованием смесей термостабильных полимераз.

Стратегия поиска генов в случаях, когда известна частичная последовательность белка или известен ряд гомологов из других организмов. ПЦР с вырожденным праймером.

Амплификация фрагментов ДНК фланкирующих участок с известной последовательностью. Inverse PCR. Vectorette PCR.

Селективная супрессия ПЦР (ССП). Параметры, влияющие на ССП-эффект. Введение инвертированных концевых повторов в структуру ДНК с помощью лигирования. Регуляция средней длины сложных продуктов ПЦР с помощью ССП.

Схема метода амплификации концевых фрагментов ДНК с использованием селективной супрессии ПЦР.

Обратные транскриптазы. Синтез кДНК обратной транскриптазой. Обратная транскрипция-ПЦР. Схема приготовления двухцепочечной кДНК. Обогащение полноразмерными последовательностями кДНК.

Приготовление кДНК по технологии SMART. Амплификация образцов кДНК. Регуляция длины амплифицированной кДНК. Источники фоновой амплификации при приготовлении кДНК по технологии SMART. Репрезентативность образцов кДНК.

Амплификация фрагментов кДНК фланкирующих участок с известной последовательностью (RACE). RACE по технологии SMART. Step-Out PCR. Регуляция длины продукта RACE.

Пиросеквенсинг. Современные платформы секвенирования. Технология секвенирования 454.

Современные платформы секвенирования. Технология секвенирования Solexa.

Современные платформы секвенирования. Технология секвенирования SoLid.

Проблемы секвенирования полных геномов. Методы отбора последовательностей экзонов (Methylation filtration и «High Cot» анализ).

Плавление и гибридизация ДНК. Факторы, влияющие на температуру плавления ДНК. Факторы, влияющие на скорость гибридизации. Кинетика гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Кривая реассоциации ДНК, содержащей повторяющиеся элементы.

Проблемы секвенирования транскриптомов. Стратегия нормализации кДНК, основанной на кинетики гибридизации нуклеиновых кислот. Нормализация кДНК с помощю дуплекс-специфической нуклеазы.

Использование чипов и микрочипов для анализа профилей экспрессии генов. Типы твердых носителей. Способы прикрепления ДНК на твердый носитель. Достоинства и недостатки технологий анализа дифференциальной экспрессии генов с помощью чипов и микрочипов. «Tissue arrays». Достоинства и недостатки метода.

Серийный анализ генной экспрессии (SAGE).

Стратегия вычитающей гибридизации. Супрессионная вычитающая гибридизация кДНК.

Гибридизация РНК in situ. Локализация белка in situ. Иммуногистохимические и иммунофлуоресцентные методы.

Флуоресцентные белки. Особенности структуры. Флуоресцентные белки как репортерные молекулы. Дальне-красные флуоресцентные белки. Использование флуоресцентных белков для локализации белков в живых клетках. Технологии многоцветного мечения с использованием CRE-рекомбиназы (brainbow). Использование флуоресцентных белков при скрининге лекарственных препаратов. Флуоресцентный таймер.

Методы анализа белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентных белков. Использование резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Фотоактивируемые флуоресцентные белки. Основные механизмы фотоактивации. Использование фотоактивации для наблюдения за динамическими процессами в живых системах. Определение скорости деградации белков.

Биосенсоры. Общий принцип устройства биосенсоров. Флуоресцентные биосенсоры на основе FRET и циркулярной пермутации флуоресцентных белков.

Способы введения мутаций в последовательность ДНК. Ненаправленный мутагенез. Направленный мутагенез с использованием ПЦР.



2010 год.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 05.03.2011