Транспорт веществ через биологические мембраны в норме и патологии

Цель данного спецкурса – познакомить студентов с основными представителями мембранных белков, обеспечивающих перенос различных соединений через клеточные и внутриклеточные мембраны: с особенностями работы систем первично-активного и вторично-активного транспорта, каналов и переносчиков – систем пассивного транспорта. Дается характеристика молекулярной организации, механизма функционирования и способов регуляции этих систем. Рассматриваются особенности исследования мембранных белков, методов их выделения и подходы к изучению активности. На ряде конкретных примеров рассматриваются патологические состояния и заболевания, связанные с нарушениями в работе мембранных транспортных систем. 

Программа курса:

Особенности строения клеток прокариот и представителей разных царств эукариот.

Фософолипиды, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды, холестерин: структура и физико-химические свойства. Фосфолипидные мицеллы, липосомы, бислои, бицеллы и нанодиски. Биологические мембраны. Асимметрия мембран. Липидные кластеры и микродомены («рафты»), их возможные функции. Подвижность липидов в мембранах. Латеральная диффузия липидов. Фосфолипазы, флиппазы и другие ферменты, участвующие в изменении свойств мембран.

Мембранные белки: трансмембранные домены на основе α-спиралей и β-складок. Способы заякоривания периферических белков в мембранах. Индексы гидропатии и предсказание вторичной структуры мембранных белков. Методы исследования мембранных белков. Атомно-силовая микроскопия, силовая микроскопия одиночных молекул и радиоинактивация в исследовании мембранных белков. Криоэлектронная микроскопия. Сys-сканирующий мутагенез. Рентгеноструктурный анализ.

Методы и объекты, используемые для изучения транспортных процессов. Получение изолированных клеток из различных тканей. Клетки животных в культуре, трансформация культивируемых клеток. Тени эритроцитов. Получение замкнутых везикул. Очистка везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Маркеры биологических мембран. Ориентация мембран в везикулах (right-side out и inside out).

Плоские липидные мембраны и липосомы. Классические и обращенные мицеллы. однослойные, малые и крупные многослойные липосомы. Липосомы с встроенными транспортными белками. Ингибирование транспорта в липосомах малых размеров. Ионофоры: валиномицин, нигерицин, монензин, А-23187. Каналообразователи: грамицидин, аламетицин. Регистрация транспорта веществ: изотопный метод, оптический метод, регистрация АТФазной активности, токи через плоскую мембрану со встроенным переносчиком, пэтч-клэмп техника.

Диффузия низкомолекулярных соединений через мембраны. Коэффициент проницаемости и скорость диффузии. Пассивный и активный транспорт веществ через мембраны. Классификация переносчиков, каналов и насосов. Ионный состав цитоплазмы клеток и внутренней среды организма. Трансмембранный потенциал и причины его возникновения. Разделение зарядов на мембране. Уравнение Нернста и Доннановское равновесие.

Первично-активный транспорт. Классификация транспортных АТФаз, их характерные свойства, внутриклеточная локализация, функции.

АТФазы Р-типа. Доменная организация и эволюция АТФаз P-типа. Общие представления о реакционном цикле АТФаз Р-типа.

Р1А и Р1В АТФазы. Распространение, особенности организации и выполняемые функции. Болезнь Вильсона-Коновалова.

Р2А АТФазы. Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) и ее изоформы. Реакционный цикл Са-АТФазы. Структура молекулы Са-АТФазы и конформационные изменения трансмембранного и цитоплазматического доменов молекулы фермента в процессе функционирования. Особенности кинетики Са-АТФазы. Олигомерная организация фермента. Белки-регуляторы Са-насоса фосфоламбан и сарколипин. Са-АТФаза секреторный путей (SPCA). Болезни человека, связанные с нарушением работы Са-АТФаз.

Р2В АТФазы. Са-АТФаза плазматических мембран и особенности её регуляции. Болезни человека, связанные с нарушением работы Са-АТФаз.

Р2С АТФазы. Na,K-АТФаза как представитель гетеродимерных АТФаз Р-типа. Открытие Na,K-АТФазы и ее идентификация как Na-насоса. Структура Na,K-АТФазы: субъединицы, их упаковка в мембране. Изоформы α- и β-субъединиц Na,K-АТФазы, их распространение и функции. Белки семейства FXYD и γ-субъединица Na,K-АТФазы. Нуклеотид-связывающий, фосфорилирующий, активаторный и трансмембранные домены Na,K-АТФазы. Третичная и четвертичная структура Na,K-АТФазы. Конформационные переходы в молекуле Na,K-АТФазы.

Функции Na,K-насоса в различных тканях: поддержание потенциала покоя и потенциала действия, транспорт сахаров и аминокислот, Na/Са- и Na/Н-антипортеры. Положительный инотропный эффект. Участие Na,K-насоса и других транспортеров в поддержании внутриклеточного рН. Участие Na,K-насоса в трансэпителиальном транспорте ионов и малых молекул. Роль Na,K-насоса в регуляции объема клетки. Na,K-АТФаза как рецептор для стероидных гормонов. Сигнальные пути, запускаемые эндогенными уабаин-подобными соединениями.

Системы, обеспечивающие секрецию соляной кислоты париетальными клетками в желудке. Структура Н,К-АТФазы, механизмы активации секреции соляной кислоты. Блокаторы Н2-рецепторов и их действие на секрецию. Семейство необратимых ингибиторов Н,К-АТФазы, механизм их действия на протонный насос. Сравнение свойств различных ингибиторов и их эффектов на Н,К-АТФазу.

Р3 АТФазы. Н-АТФаза растений, ее роль в поглощении солей корнями растений, регуляция активности за счет аутоингибиторного домена.

Р4 и Р5 АТФазы. Особенности молекулярной организации и выполняемые функции.

АТФазы V-типа: молекулярная организация и функционирование в сравнении с АТФазами F-типа. Локализация АТФаз V-типа во внутриклеточных мембранах (эндосомы и лизосомы) и в плазматической мембране клеток животных. Роль в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте, в проникновении в клетку бактерий и вирусов, в процессинге секретируемых белков и обратном транспорте в синаптосомах. Функции АТФаз V-типа в плазматической мембране остеокластов, макрофагов, интеркалярных клетках почечного эпителия и сенсорных клетках кортиевого органа, в процессе метастазирования опухолей. Регуляция активности АТФаз V-типа и роль протеинкиназ в этом процессе.

АВС-суперсемейство АТФаз и множественная устойчивость к лекарствам. АВС-АТФазы прокариот и эукариот. MDR1 человека, его структура и механизм работы. Структура генов представителей семейства АВС. Бактериальные флоппазы и пермеазы. Участие периплазматических субстрат-связывающих белков в работе пермеаз. TolC – бактериальный белок, обеспечивающий перенос различных соединений через периплазматическое пространство. Представители суперсемейства АВС, выполняющие неканонические функции (CFTR и SUR), особенности их организации и функционирования. Муковисцидоз.

Ионные каналы, их классификация, особенности структуры. Ионные радиусы и размеры пор ионных каналов. Ионная селективность и механизм работы селективных фильтров. Селективный фильтр, пора и калитка ионных каналов. Принципы работы калитки. Моделирование гидрофильных и гидрофобных калиток в мембранах («нанопоры»). Представители каналов с гидрофобными и гидрофильными калитками.

Лиганд-управляемые ионные каналы, их основные классы. Семейство «cys-loop»-каналов. Ацетилхолиновый рецептор: особенности структуры и функционирования. Хлорные каналы (глициновые рецепторы). Глутаматные рецепторы. Пуринорецепторы.

Потенциал-чувствительные ионные каналы. Особенности структурной организации потенциал-чувствительных К⁺-, Na⁺- и Са²⁺-каналов. Методы регистрации одиночных каналов. Параметры работы ионных каналов, определяемые в электрофизиологических экспериментах. Потенциал действия. К⁺-канал дрозофилы Shaker и особенности его работы. Понятие об ион-селективном фильтре канала и принципе его работы. Ион-селективные фильтры К⁺-каналов. Калитка (ворота) канала и управление ее работой. Конформационные переходы и управление работой калитки. Работа «сенсора напряжения» потенциал-чувствительных каналов.

Каналы, управляемые внутриклеточными сигналами. Участие цГМФ-активируемых каналов в фоторецепции. Предполагаемая структура цГМФ-управляемого канала. Участие цАМФ-активируемых Са-каналов и Са-активируемых Сl-каналов в работе обонятельных рецепторов. Участие РКА-регулируемых К-каналов во вкусовой рецепции.

SOC-каналы. Каналы, управляемые метаболитами липидного обмена. Участие TRP/TRPL-каналов в работе фоторецепторов насекомых. TRP-каналы млекопитающих. SOC и белки Orai и STIM.

Роль кальция как вторичного посредника в разных типах клеток и Са-зависимые регуляторные пути. Потенциал-чувствительные Са-каналы плазматической мембраны (дигидропиридиновые рецепторы), их типы и принципы классификации. Роль в электромеханическом сопряжении.

Внутриклеточные Са-каналы. Са-каналы (рианодиновые рецепторы): молекулярная организация и особенности регуляции. Белки «соединительных ножек» и рианодиновые рецепторы: идентификация и очистка. Структура рианодинового рецептора. Изоформы рианодинового рецептора, экспрессирующиеся в разных тканях. Активаторы и ингибиторы рианодиновых рецепторов. Особенности структурной организации триад в скелетных мышцах и диад в миокарде.

Взаимодействие рианодиновых и дигидропиридиновых рецепторов. Белки-регуляторы рианодиновых рецепторов. Механизм электромеханического сропряжения в скелетной и сердечной мышцах. Циклическая АДФ-рибоза как основной активатор Са-каналов в гладких мышцах и немышечных тканях. Регуляция сердечной изоформы рианодинового рецептора протеинкиназой А и сердечная недостаточность. Злокачественная гипертермия и Central Core Desease. Нагревательный орган рыб, участие Са-каналов и Са-АТФазы ретикулума в термогенезе.

Рецепторы инозитолтрисфосфата. Фосфатидилинозитол как предшественник вторичных посредников. Структура IP3-рецепторов. Функциональные домены IP3-рецепторов. Сходство и различие IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Регуляция IP3-рецепторов кальмодулином. Белок IRBIТ и другие белки, взаимодействующие с IP3-рецепторами. Белок Homer и формирование кластеров рецепторов плазматических мембран и внутриклеточных органелл. «Са-осцилляторы» и совместная работа IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Внутриклеточные посредники cADPR и NAADP.

Двупоровые каналы ТРС и их участие во внутриклеточной сигнализации.

Принципы пассивного и вторично-активного переноса веществ через мембраны. Переносчики суперсемейства MFS, особенности их структуры и механизм функционирования. Способы анализа аминокислотной последовательности мембранных белков и предсказания их вторичной структуры. Структура переносчика лактозы LacY и особенности его функционирования. Участие белков суперсемейства MFS в лекарственной устойчивости бактерий.

Переносчик глюкозы GLUT1, его структура и основные кинетические свойства. Анализ олигомерной организации мембранных белков и способы исследования их расположения в мембране (Cys-сканирующий мутагенез). Амфипатические α-спирали и формирование гидрофильных полостей в мембране. Семейство переносчиков GLUT-HMIT, распространение, кинетические характеристики, функции в разных тканях, особенности структуры (sugar/polyol transporter signature). Переносчики SGLT и транспорт глюкозы через эпителий в тонком кишечнике и почках. Переносчики семейства SWEET.

Заболевания, связанные с нарушением работы переносчиков глюкозы, и способы их коррекции. Нарушение поглощения глюкозы и галактозы в кишечнике. Конвульсивные состояния новорожденных и синдром De Vivo. Синдром Фанкони-Бискела. Механизм стимуляции инсулином поглощения глюкозы в скелетных мышцах, сердце, жировой ткани и диабет II типа. АТФ-управляемые К-каналы в поджелудочной железе и инсулинопатии.

Фосфатидилинозитол как предшественник ряда вторичных посредников. IP3-киназа. Два пути стимуляции инсулином встраивания везикул, содержащих переносчик GLUT4, в плазматическую мембрану.

Антипортеры и симпортеры. Na/Ca-обменник, его структура и физиологическая роль. Участие НСО₃/Сl-антипортера (белок АЕ1, белок полосы III) в транспорте СО₂ эритроцитами. Зависимость активности основных мембранных переносчиков, регулирующих внутриклеточный рН, от значения рН цитоплазмы. Участие ионных насосов, антипортеров и каналов в секреции соляной кислоты париетальными клетками желудочных желез. Участие антипортеров и каналов в накоплении солей и сахарозы вакуолями растительных клеток. Аквапорины и глицеропорины. Доказательства существования аквапоринов. Структуры воды и водородные связи. Молекулярная структура канала. Аквопорин как канал без калитки. свойства канала, обеспечивающие проведение воды, но не ионов (включая Н⁺): селективный фильтр, электростатическое отталкивание Н⁺, образование водородных связей с каналом. Разнообразие аквапоринов человека, аквапорины прокариот и растений. Заболевания человека, связанные с мутациями в аквапоринах (наследственная катаракта, несахарный диабет, сердечная недостаточность, ишемические поражения и водянка мозга). Аквапорины и транспорт металлоидов.

Список рекомендуемой литературы:

1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. Garland Science. 2002.
2. Arge P., Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 72-78.
3. Baumann O, Walz B. The blowfly salivary gland - a model system for analyzing the regulation of plasma membrane V-ATPase. J Insect Physiol. 2012 Apr;58(4):450-458.
4. Borgnia M., Nielsen S., Engel A., Arge P. Cellular and molecular biology of aquaporin water channels. Annu. Rev. Biochem. 1999. v. 68, pp. 425-458.
5. Bozoky Z, Krzeminski M, Chong PA, Forman-Kay JD. Structural changes of CFTR R region upon phosphorylation: a plastic platform for intramolecular and
6. intermolecular interactions. FEBS J. 2013 Sep;280(18):4407-4416.
7. Brown G.K. Glucose transporters: structure, function and consequences of deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 2000. v. 23, pp. 237-246.
8. Cancela M.J. Specific Ca2+ signaling evoked by cholecystokinin and acethylcholine: the roles of NAADP, cADPR, and IP3. Ann. Rev. Physiol. 2001. v. 63, pp. 99-117.
9. Carterall W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. v. 16, p. 521-555.
10. Day RE, Kitchen P, Owen DS, Bland C, Marshall L, Conner AC, Bill RM, Conner MT. Human aquaporins: regulators of transcellular water flow. Biochim Biophys Acta. 2014 May;1840(5):1492-1506.
11. Donowitz M, Ming Tse C, Fuster D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na⁺/H⁺ exchangers. Mol Aspects Med. 2013 Apr-Jun;34(2-3):236-251.
12. Chang G. Multidrug resistance ABC transporters. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 102-105.
13. Flores-Soto ME, Chaparro-Huerta V, Escoto-Delgadillo M, Vazquez-Valls E, González-Castañeda RE, Beas-Zarate C. Structure and function of NMDA-type glutamate receptor subunits. Neurologia. 2012 Jun;27(5):301-310.
14. Gonzalez M.E., Carrasco L. Viroporins. FEBS Lett. 2003. v. 552, pp. 28-34.
15. Guse AH. Calcium mobilizing second messengers derived from NAD. Biochim Biophys Acta. 2015 Sep;1854(9):1132-1137.
16. Hardie R.C. Regulation of TRP channels via lipid second messengers. Ann. Rev. Physiol. 2003. v. 65, pp. 735-759.
17. Hruz P.W., Mueckler M.M. Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter. Molec. Membr. Biol. 2001. v. 18, pp. 183-193.
18. Lodish H., Berk A., Zipurski S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. Molecular Cell Biology. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2001.
19. Lopina O.D. Na,K-ATPase: structure, mechanism, and regulation. Membr. Cell Biol. 2000. v. 13, pp. 721-744.
20. MacKinnon R.M. Potassium channels. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 62-65.
21. MacLennan D.H. Ca2+ signaling and muscle disease. Eur. J. Biochem. 2000. v. 267, pp. 5291-5297.
22. Matulef K., Zagotta W.N. Cyclic nucleotide gated ion channels. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. v. 19, pp. 23-44.
23. Mikoshiba K. IP3 receptor/Ca2+ channel: from discovery to new signaling concepts. J Neurochem. 2007 Sep;102(5):1426-46.
24. Moller J.V., Juul B., le Maire M. Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 1996. v. 1286, pp. 1-51.
25. Nelson D.L., Cox M.M. Leninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2005.
26. Nishi T., Forgac M. The vacuolar (H+)-ATPases – nature’s most versatile proton pumps. Nature Rev., 2002. v. 3, pp. 94-103.
27. Ogawa Y., Kurebayashi N., Murayama T. Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 1999. v. 36, pp. 27-64.
28. Patel S, Cai X. Evolution of acidic Ca²⁺ stores and their resident Ca²⁺-permeable channels. Cell Calcium. 2015 Mar;57(3):222-230.
29. Pedersen P.L. Transport ATPases in biology systems and relationship to human disease: a brief overview. J. Bioenerg. Biomembr. 2002. v. 34, pp. 327-332.
30. Perland E, Fredriksson R. Classification Systems of Secondary Active Transporters. Trends Pharmacol Sci. 2017 Mar;38(3):305-315.
31. Pouliquin P, Dulhunty AF. Homer and the ryanodine receptor. Eur Biophys J. 2009 Dec;39(1):91-102
32. Procko E, O'Mara ML, Bennett WF, Tieleman DP, Gaudet R. The mechanism of ABC transporters: general lessons from structural and functional studies of an antigenic peptide transporter. FASEB J. 2009 May;23(5):1287-1302.
33. Quistgaard EM, Löw C, Guettou F, Nordlund P. Understanding transport by the major facilitator superfamily (MFS): structures pave the way. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Feb;17(2):123-132.
34. Rahman T, Taylor CW. Dynamic regulation of IP3 receptor clustering and activity by IP3. Channels (Austin). 2009 Jul-Aug;3(4):226-232.
35. Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 17-36.
36. Tao Y, Cheung LS, Li S, Eom JS, Chen LQ, Xu Y, Perry K, Frommer WB, Feng L. Structure of a eukaryotic SWEET transporter in a homotrimeric complex. Nature. 2015 Nov 12;527(7577):259-263.
37. Theodoulou F.L. Plant ABC transporters. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 79-103.
38. Thomas U. Modulation of synaptic signaling complexes by Homer protein. J. Neurochem. 2002. v. 81, pp. 407-413.
39. Toyoshima C., Inesi G. Structural basis of ion pumping by Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 2004. v. 73, pp. 269-292.
40. Urwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS Lett. 2003. v. 555, pp. 91-95.
41. Wood I.S., Trayhurm P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded families of sugar transport proteins. Br. J. Nutr. 2003. v. 89, pp. 3-9.
42. Yan N. Structural Biology of the Major Facilitator Superfamily Transporters. Annu Rev Biophys. 2015;44:257-83
43. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-АТФазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1389-1400.
44. Лопина О.Д., Рубцов А.М. Н,К-АТФаза и регуляция секреции НСl слизистой оболочкой желудка. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1235-1242.
45. Рубцов А.М. Молекулярные механизмы регуляции активности Са-каналов сарокоплазматического ретикулума, утомление мышц и феномен Северина. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1401-1414.
46. Рубцов А.М., Батрукова М.А. Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1091-1105.