Раздел малого практикума. Задачи по генной инженерии.

Раздел малого практикума по биохимии «Задачи по генной инженерии» ставит своей целью ознакомить студентов с рядом основных современных генно-инженерных методов, применяемых повсеместно в современных лабораториях для решения научно-исследовательских и прикладных задач. Практические занятия помогут студентам ознакомиться с основными понятиями и терминологией генной инженерии, а также с приемами работы и манипуляциями с бактериальной культурой и рекомбинантной ДНК.

В данной серии задач студенты осваивают такие методы генной инженерии, как выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli методом щелочного лизиса и определение ее концентрации на примере плазмиды, несущей кодирующую последовательность гена человеческого тропонина I. Концентрация плазмидной ДНК определяется методом электрофореза в агарозном геле. Кроме того, студенты проводят рестрикционный и ПЦР анализы очищенной плазмиды, трансформацию компетентных клеток E. coli экспрессионного штамма Rosetta полученной плазмидой методом химической трансформации, а также экспрессию человеческого тропонина I, с последующим анализом полученных результатов с помощью электрофореза в ПААГ.

Лекторы - доцент Н.Н. Киреева, ст.н.с., к.б.н. Д.В. Серебряная
Время проведения: весенний семестр III курса для студентов кафедр физиологии человека и животных, эмбриологии и высшей нервной деятельности.
Продолжительность курса: 4 занятия по 4 часа. Помимо практической работы студенты прослушивают 2 теоретические лекции.
Форма отчетности: Сдача задач теоретически и в виде отчета. Студенты, не сдавшие задачи в течение двух недель после окончания занятий, продолжают сдачу во время экзаменационной сессии в день экзамена по биохимии.
Альтернативный курс:

Программа курса
Вопросы к экзамену

Программа курса:

Задача 1. Получение и характеристика препарата плазмидной ДНК pET23a+/rhcTnI. Выделение и очистка плазмидной ДНК из «ночной» культуры бактерий. Определение концентрации ДНК полученной плазмиды. Определение концентрации и чистоты полученного препарата плазмиды методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Электрофоретические методы анализа ДНК. Электрофорез в агарозном геле.

Задача 2. Анализ плазмиды pet23a+/rhcTnI с помощью рестрикционного анализа и полимеразной цепной реакции. Проведение рестрикционного анализа выделенной плазмиды. Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Анализ плазмиды pET23a+/rhcTnI методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция. Состав компонентов реакционной смеси ПЦР. Трансформация бактерий штамма Rosetta 2(DE3)pLysS полученной плазмидой pET23a+/rhcTnI. Трансформация E. coli .

Задача 3. Экспрессия рекомбинантного тропонина I сердца человека. Структура лактозного оперона. Экспрессия рекомбинантных белков в pET-системе. Размножение E. coli в питательных средах. Питательные среды для роста E. coli. Факторы, оказывающие влияние на рост бактерий.

Задача 4. Анализ экспресии рекомбинантного тропонина I методом электрофореза в полиакриламидном геле. Особенности синтеза рекомбинантных белков в бактериальной системе экспрессии. Определение локализации белка в бактериальной клетке после экспрессии. Выбор подходящих вектора и штамма бактерий для экспрессии растворимого белка. Идентификация и очистка рекомбинантного белка.

Список рекомендуемой литературы:

  1. Н.Н. Киреева, Д.В. Серебряная. Методы генной инженерии в биохимии. Учебно-методическое пособие. Москва, Биофак МГУ им. М.В.Ломоносова. 2017.
  2. Серебряная Д.В., Розов Ф.Н. Практическая генная инженерия. Учебно-методическое пособие. Москва, «Цифровичок», 2013.
  3. pET System Manual, Novagen, 2003.
  4. Plasmid DNA, QIAGEN protocol, 2001.
  5. Sambrook J. & Russel D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 2001.
  6. Watson J.D., et al. Molecular biology of the gene. 5th ed. “Pearson”, 2004.