Ферменты. Структурные основы и молекулярные механизмы регуляции активности

Курс посвящен рассмотрению основных механизмов ферментативного катализа, роли конформационной подвижности белка в катализе, механизмам изоляции активных центров от окружающей среды, правильной ориентации субстрата в активном центре и оценке вклада этих механизмов в ускорении реакции. Рассматриваются также механизмы регуляции ферментативной активности и механизмы функционирования полиферментных систем. Обсуждаются возможности практического применения принципов ферментативного катализа.

Программа курса:

1. Классификация ферментов, понятие об активном и аллостерических центрах ферментов. Основные принципы, заложенные в классификацию ферментов. Свойства ферментов как катализаторов, сходство и различия химического и ферментативного катализа. Снижение скорости химической реакции за счет иммобилизации субстрата. Понятие об эффективном катализаторе как о макромолекуле. Строение активных центров ферментов.

2. Молекулярные механизмы конформационной подвижности белков и ее функциональное значение. Характеристика типов подвижности белков. Методы регистрации конформационных состояний белков в растворах. Роль существования конформеров фермента со сходными величинами свободной энергии в ферментативном катализе. Равновесие между открытой и закрытой конформациями доменов в ферментах. Связывание лигандов с ферментом по механизму конформационной селекции, индукция закрытого состояния путем связывания лиганда. Взаимосвязь между конформационными изменениями активного центра и сетью внутримолекулярных взаимодействий. Типы движения доменов: скольжение, движение на шарнирах, движение петель и роль этих движений в катализе.

3. Принципы ферментативного катализа. Энергетический профиль односубстратной некатализируемой химической реакции. Понятие переходного состояния химической реакции. Энергия активации и константа скорости химической реакции, соотношение между ними. Энергетический профиль простейшей односубстратной ферментативной реакции. Образование фермент-субстратного комплекса и его роль в катализе. Природа сил, вовлеченных в связывание фермента с субстратом. Конформационная лабильность ферментов как основа ферментативного катализа и механизмов его регуляции. Доказательства комплементарности активного центра и переходного состояния на примере тирозил-тРНК-синтетазы. Кооперативные взаимодействия внутри молекулы фермента и их роль в катализе. Роль низкобарьерных водородных связей в эффективности катализа.

4. Химические механизмы стабилизации переходных состояний ферментативных реакций. Способы оценки вклада взаимодействий между разными функциональными группами фермента и субстрата в стабилизацию основного и переходного состояния. Использование для этих целей химической модификации аминокислотных остатков, участвующих в катализе. Химическая модификация субстрата, направленная на взаимодействие с аминокислотными остатками активного центра – достоинства и недостатки подхода. Использование направленного мутагенеза для оценки вклада различных функциональных групп фермента в прочность взаимодействия субстрата, стабилизацию конформационного состояния и возможность связывания субстрата и диссоциации продукта реакции.

5. Типы катализа, используемые ферментами. Общие кислоты и основания в молекулах белков. Зависимость величин рКа от микроокружения аминокислотного остатка и важность этого фактора в катализе. Каталитический механизм аспартатных протеиназ. Пепсин: структурные основы активации: отщепление пропептида и механизм катализа. Структура и кинетический механизм рибонуклеазы А. Структура и каталитический механизм триозофосфатизомеразы. Факторы, обеспечивающие эффективность и специфичность ферментативного катализа.

1. Ковалентный катализ. Общая характеристика.
2. Нуклеофильный катализ. Каталитический механизм сериновых протеиназ. Химотрипсин – механизм активации и характеристика отдельных стадий реакции. Каталитический механизм цистеиновых протеиназ и альдегиддегидрогеназ. Нуклеофильный катализ в действии фосфатаз и фосфокиназ.
3. Электрофильный катализ, его особенности. Сочетание элементов нуклеофильного и электрофильного катализа. Катализ с образованием оснований Шиффа. Электрофильный катализ с участием коферментов: пиридоксаль-5-фосфат и тиаминпирофосфат. Катализ ионами металлов. Металлопротеиназы.
4. Специфичность катализа: сравнение специфичности и структуры связывающего центра различных протеиназ.

6. Структура и каталитические свойства NAD(P)- и АТР-зависимых ферментов. Конформация NAD и АТР в растворе и в комплексе с дегидрогеназами. Роль различных частей молекулы NAD в связывании с ферментом и в катализе. Специфичность ферментов по отношению к NAD и NADP и связь специфичности со структурой связывающего центра. Специфичность переноса гидрид-иона. Структура и каталитический механизм лактат-, алкоголь-, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. Закономерности, определяющие взаимосвязь структуры и функциональных свойств этих ферментов.

7. Механизмы регуляции активности ферментов. Прямое влияние на активный центр (действие конкурентных и неконкурентных ингибиторов, ингибирование избытком субстрата, ковалентная модификация аминокислот активного центра). Механизм активации сАМР-зависимой протеинкиназы. Аллостерические эффекты. Регуляторные домен, регуляторные субъединицы. Роль олигомерной структуры, понятие о межсубъединичной кооперативности. Примеры, иллюстрирующие молекулярные механизмы аллостерической регуляции активности пируваткиназы, гликогенфосфорилазы, фруктозо-1,6-бисфосфатазы, пируваткиназы.

8. Полифункциональные ферменты и полиферментные комплексы. Структурные основы туннелирования интермедиата между активными центрами, формируемыми разными доменами или субъединицами (триптофансинтаза, глюкозамин-6-фосфатсинтаза). Направленное движение интермедиата по «шоссе» на поверхности молекулы тимидилатсинтазы/ дигидро-фолатредуктазы. Молекулярные механизмы согласования работы активных центров, соединенных туннелем или шоссе.

9. Каталитические антитела (абзимы) как примитивные ферменты. Теоретические предпосылки создания абзимов и их практическая реализация. Экспериментальные подходы к получению антител, катализирующих разные реакции. Примеры, иллюстрирующие сходство общих принципов функционирования абзимов и ферментов. Методы усовершенствования функциональных свойств абзимов. Генно-инженерные подходы к получению каталитических антител. Практическое использование абзимов.

Список рекомендуемой литературы:

1. М. Бендер, Р. Бергельсон, М. Комияма. Биоорганическая химия ферментативного катализа. Мир. М. 1987.
2. Н.К. Наградова. Как работают ферменты. Энциклопедия «Современное естествознание», Молекулярные основы биологических процессов (ред. В.Н. Сойфер), т. 8, с. 158-168, Магистр-Пресс, 2000.
3. Н.К. Наградова. Олигомерная структура ферментов и ее функциональная роль. Там же, с. 149-157.
4. Н.К. Наградова. Каталитические антитела. Там же, с. 174-181.
5. A.R. Fersht, R.J. Leatherbarrow, T.N. Wells. Binding energy and catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. TIBS, v. 11, p. 321-325, 1986.
6. P.G. Schultz. The interplay between chemistry and biology in the design of еnzymatic catalysis. Science, v. 240, p.426-443. 1988.
7. A.R. Clarke, T. Atkinson, J.J. Holbrook. From analysis to synthesis: new ligand binding sites on the lactate dehydrogenase framework. Part I. TIBS, v.14, p. 145-148, 1989.
8. J.R. Knowles. Enzyme catalysis: not different, just better. Nature, v. 350. P. 121-124, 1991.
9. A. Mattevi, M. Bolognesi, G. Valentini The allosteric regulation of pyruvate kinase. FEBS Letter, v. 389. P.11-15, 1996.
10. P. Pan, E. Woehl, M.F. Dunn. Protein architecture, dynamics and allostery in tryptophan synthase channeling. TIBS, v. 22, p. 22-27, 1997.
11. E.W. Miles, S. Rhee, D.R. Davies The molecular basis of substrate channeling. J. Biol. Chem. V. 274, p.12193-12196, 1999.
12. RN. Perham. Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions. Annu. Rev. Biochem. 69:961-1004. 2000.
13. S. Ghisla, C. Thorpe. Acyl-CoA dehydrogenases. A mechanistic overview. Eur. J. Biochem. 271(3):494-508, 2004.
14. M.A. Vanoni, L. Dossena , R.H. van den Heuvel , B. Curti. Structure-function studies on the complex iron-sulfur flavoprotein glutamate synthase: the key enzyme of ammonia assimilation. Photosynth. Res. 83(2):219-38, 2005.
15. G. Lippens, I. Landrieu, C. Smet. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 2007 274(20):5211-22, 2007.
16. S.J. Benkovic, GG. Hammes, S. Hammes-Schiffer Free-energy landscape of enzyme catalysis. Biochemistry.47(11):3317-21. 2008.
17. G.L. Waldrop, HM.Holden, M. St Maurice. The enzymes of biotin dependent CO₂ metabolism: what structures reveal about their reaction mechanisms. Protein Sci. 21(11):1597-619, 2012.
18. M. Deponte. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1830(5):3217-66 2013.
19. R.S. Phillips. Chemistry and diversity of pyridoxal-5'-phosphate dependent enzymes. Biochim Biophys Acta. 1854(9):1167-74, 2015.
20. B.H. Shilton. Active transporters as enzymes: an energetic framework applied to major facilitator superfamily and ABC importer systems. Biochem. J. 467(2):193-9, 2015.
21. E. Flashman. Basic Enzymology. University of Oxford. Trinity Term. 2015.
22. P.K. Agarwal , N. Doucet , C. Chennubhotla , A. Ramanathan, C. Narayanan. Conformational Sub-states and Populations in Enzyme Catalysis. Methods Enzymol. 578:273-97, 2016.
23. C.T. Supuran. Structure and function of carbonic anhydrases. Biochem. J. 473(14):2023-32, 2016.
24. S. Dajnowicz, RC. Johnston, JM. Parks, MP. Blakeley, DA. Keen, KL.Weiss, O.Gerlits, A. Kovalevsky, TC. Mueser. Direct visualization of critical hydrogen atoms in a pyridoxal 5'-phosphate enzyme. Nat. Commun. 8(1), 955, 2017.
25. AA. Ukuwela, AI. Bush. Reduction potentials of protein disulfides and catalysis of glutathionylation and deglutathionylation by glutaredoxin enzymes. Biochem. J. 474(22):3799-3815, 2017.
26. TL. Amyes, MM. Malabanan, X. Zhai, AC. Reyes, J.P. Richard. Enzyme activation through the utilization of intrinsic dianion binding energy. Protein Eng. Des. Sel. 30(3):157-165, 2017.
27. B. Wielgus-Kutrowska, T. Grycuk, A. Bzowska. Part-of-the-sites binding and reactivity in the homooligomeric enzymes - facts and artifacts. Arch. Biochem. Biophys. 642:31-45, 2018.
28. J. Azadmanesh, EO. Gloria, A. Borgstahl. Review of the Catalytic Mechanism of Human Manganese Superoxide Dismutase.Antioxidants (Basel). 7(2): 25, Protein Sci. 21(11):1597-619, 2018.