Роль Na+,K+-АТФазы в функционировании клеток и проведении сигналов

Руководитель группы - ведущий научный сотрудник, профессор, д.б.н. Лопина Ольга Дмитриевна

Лопина Ольга Дмитриевна

Руководитель группы – ведущий научный сотрудник, д.б.н. О.Д. Лопина

Кардиотонические стероиды, связываясь с Na,K-АТPазой, ингибируют этот фермент. В сердце ингибирование насоса приводит к повышению внутриклеточной концентрации Na+ и к активации Na/Ca-обменника, который увеличивает вход в клетку Са2+. Это, в свою очередь, усиливает сокращение сердечной мышцы. Но одновременно связывание уабаина обеспечивает изменение конформации Na,K-АТPазы. Это приводит к связыванию с ней Src-киназы и к активации последней. После этого происходит фосфорилирование Src-киназой эпидермального фактора роста и мобилизация малых GTP-связывающих белков, что включает сигнальный каскад, влияющий в конечном итоге на экспрессию генов, вызывая гипертрофию сердечной мышцы.

Иная ситуация наблюдается в эпителии почек: связывание уабаина с Na,K-АТPазой приводит к смерти клеток эпителия, эта смерть не связана с ингибированием Na,K-АТPазы, а вызвана изменением ее конформации и последующим связыванием с ферментом белков, инициирующих сигнальный каскад, что приводит к активации Erk-киназы и последующей смерти клеток. Другой кардиотонический стероид, маринобуфагенин, не вызывает смерть клеток эпителия почек, хотя он ингибирует Na,K-АТPазу так же, как и уабаин. Таким образом, связывание кардиотонических стероидов с Na,K-АТPазой приводит к осуществлению неклассических функций Na,K-АТPазы, которые обеспечиваются включением сигнальных каскадов.

Исследование конформационных изменений фермента под действием уабаина и маринобуфагенина показало, что сродство уабаина к Na,K-ATPазе в ходе каталитического цикла меняется значительно (минимум в 100 раз), тогда как сродство маринобуфагенина к нему остается практически неизменным, при этом оба КТС обладают схожим ингибирующим действием на Na,K-АТРазу. Методом молекулярного моделирования мы установили, что в обоих случаях связывание фермента с молекулами кардиостероидов происходит с теми же гидрофобными остатками фермента, но в случае маринобуфагенина уменьшается количества водородных связей, образованных им с Na,K-ATPазой.Это показывает, что связывание уабаина и маринобуфагенина приводит к различным конформационным изменениям молекулы фермента и, вероятно, может привести к связыванию Na,K-ATPазы с различными белками-партнерами и запуску различных сигнальных каскадов.

Анализ транскриптомных изменений, происходящих в клетках эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) под действием уабаина и маринобуфагенина, показал различие в уровнях транскрипции ряда генов для обоих КТС, при этом обязательным условием данных изменений является увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i. Гены, транскрипция которых изменялась в условиях наших экспериментов, вовлечены в процессы регуляции транскрипции и трансляции, а также имеют отношение к клеточному росту, дифференцировке и смерти.

Второе направление работы - изучение процесса модификации SH-групп Na,K-АТРазы (среди которых их окисление до –SOH, -SO2H и -SO3H, а также нитрозилирование и глутатионилирование) и их роли в работе фермента. Внутриклеточный трипептид глутатион существует в цитоплазме клеток в окисленной и восстановленной формах. Соотношение окисленной и восстановленной форм глутатиона определяет редокс-состояние клетки, оно снижается при окислительном стрессе. Мы установили, что Na,K-АТРаза выделяется из клетки в состоянии, когда до 13 из 15 экспонированных в цитозоль SH-групп каталитической субъединицы Na,K-АТPазы содержат связанный глутатион. Модификация окисленным глутатионом еще трех SH-групп, расположенных вблизи активного центра фермента, приводит к полной потере его активности, что обусловлено созданием стерического препятствия для связывания АТР. Глутатион с этих SH-групп можно удалить с восстановлением активности с помощью системы ферментов глутаредоксин/ глутатионредуктаза. Этот процесс, по-видимому, происходит in vivo и имеет важное физиологическое значение, поскольку в некоторых клетках Na,K-АТPаза потребляет до 40% от общего количества АТР.

Установлено также, что три других цистеиновых остатка подвергаются глутатионилированию котрансляционно, модификация этих SH-групп обеспечивает правильное сворачивание полипептидной цепи в процессе ее синтеза. Удалить глутатион с этих остатков цистеина не удается даже в присутствии 8 М мочевины. Дополнительное глутатионилирование или нитрозилирование еще 6 остатков, которое происходит в результате окислительного стресса, выполняет либо защитную функцию, предотвращая необратимое окисление остатков цистеина, либо структурную функцию, влияя на конформацию белка и скорость его протеолиза, в частности, после связывания уабаина. Последнее, по-видимому, играет важную роль в прекращении сигнала, инициируемого связыванием уабаина.

Группа работает на кафедре биохимии в комнатах 136 и 138. Руководитель группы – Лопина Ольга Дмитриевна, ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук, профессор. Под ее руководством защищено 8 кандидатских диссертаций. Работа коллектива на протяжении последних 20 лет финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных исследований, а также международным грантом INTAS. Группа работает в тесном сотрудничестве с коллективом лаборатории мембран биологического факультета МГУ, руководимой профессором С.Н. Орловым, а также с лабораторией конформационной стабильности белков и физических методов анализа института Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта (руководитель лаборатории академик РАН А.А. Макаров).

Основные публикации группы, сделанные в сотрудничестве с этими коллективами, представлены ниже:

  1. Orlov SN, Klimanova EA, Tverskoi AM, Vladychenskaya EA, Smolyaninova LV, Lopina OD. Nai,Ki-Dependent and -Independent Signaling Triggered by Cardiotonic Steroids: Facts and Artifacts, Molecules. 2017, 22(4), pii: E635
  2. Klimanova EA, Tverskoi AM, Koltsova SV, Sidorenko SV, Lopina OD, Tremblay J, Hamet P, Kapilevich LV, Orlov SN. Time- and dose dependent actions of cardiotonic steroids on transcriptome and intracellular content of Na+ and K+: a comparative analysis. Sci Rep. 2017, 7:45403.
  3. Dergousova EA, Petrushanko IY, Klimanova EA, Mitkevich VA, Ziganshin RH, Lopina OD, Makarov AA. Effect of Reduction of Redox Modifications of Cys-Residues in the Na,K-ATPase α1-Subunit on Its Activity. Biomolecules. 2017, 7(1). pii: E18.
  4. Klimanova EA, Petrushanko IY, Mitkevich VA, Anashkina AA, Orlov SN, Makarov AA, Lopina OD. Binding of ouabain and marinobufagenin leads to different structural changes in Na,K-ATPase and depends on the enzyme conformation. FEBS Lett. 2015, 589(19 Pt B):2668-74.
  5. 5. Akimova OA, Tverskoi AM, Smolyaninova LV, Mongin AA, Lopina OD, La J, Dulin NO, Orlov SN. Critical role of the α1-Na(+), K(+)-ATPase subunit in insensitivity of rodent cells to cytotoxic action of ouabain. Apoptosis. 2015, 20(9):1200-10.
  6. Petrushanko IY, Mitkevich VA, Anashkina AA, Klimanova EA, Dergousova EA, Lopina OD, Makarov AA. Critical role of γ-phosphate in structural transition of Na,K-ATPase upon ATP binding. Sci Rep. 2014, 4; 4:5165.

Состав группы:

Руководитель группы:
Инженер-исследователь:
Ассистент:
Аспирант:
Бакалавр IV курса:
 д.б.н., в.н.с. О.Д. Лопина
 Ю.В. Каманина
 к.б.н. Е.А. Климанова
 Е.А. Дергоусова
 Л.А. Варфоломеева

Комната № 138

группа О.Д. Лопиной





версия для печати
Страница последний раз обновлялась 28.03.2018