Транспорт веществ через биологические мембраны в норме и патологии

Цель данного спецкурса – познакомить студентов с основными представителями мембранных белков, обеспечивающих перенос различных соединений через клеточные и внутриклеточные мембраны: с особенностями работы систем первично-активного и вторично-активного транспорта, каналов и переносчиков – систем пассивного транспорта. Дается характеристика молекулярной организации, механизма функционирования и способов регуляции этих систем. Рассматриваются особенности исследования мембранных белков, методов их выделения и подходы к изучению активности. На ряде конкретных примеров рассматриваются патологические состояния и заболевания, связанные с нарушениями в работе мембранных транспортных систем.

Рубцов Александр Михайлович

Лектор - профессор, д.б.н. А.М. Рубцов

Время проведения: IV курс бакалавриата, VII семестр
Продолжительность курса: 12 лекций
Форма отчетности: Зачет
Альтернативный курс: Нет

Программа курса
Вопросы к зачету

Программа курса:

Особенности строения клеток прокариот и представителей разных царств эукариот.

Фософолипиды, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды, холестерин: структура и физико-химические свойства. Фосфолипидные мицеллы, липосомы, бислои, бицеллы и нанодиски. Биологические мембраны. Асимметрия мембран. Липидные кластеры и микродомены («рафты»), их возможные функции. Подвижность липидов в мембранах. Латеральная диффузия липидов. Фосфолипазы, флиппазы и другие ферменты, участвующие в изменении свойств мембран.

Мембранные белки: трансмембранные домены на основе α-спиралей и β-складок. Способы заякоривания периферических белков в мембранах. Индексы гидропатии и предсказание вторичной структуры мембранных белков. Методы исследования мембранных белков. Атомно-силовая микроскопия, силовая микроскопия одиночных молекул и радиоинактивация в исследовании мембранных белков. Криоэлектронная микроскопия. Сys-сканирующий мутагенез. Рентгеноструктурный анализ.

Методы и объекты, используемые для изучения транспортных процессов. Получение изолированных клеток из различных тканей. Клетки животных в культуре, трансформация культивируемых клеток. Тени эритроцитов. Получение замкнутых везикул. Очистка везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Маркеры биологических мембран. Ориентация мембран в везикулах (right-side out и inside out).

Плоские липидные мембраны и липосомы. Классические и обращенные мицеллы. однослойные, малые и крупные многослойные липосомы. Липосомы с встроенными транспортными белками. Ингибирование транспорта в липосомах малых размеров. Ионофоры: валиномицин, нигерицин, монензин, А-23187. Каналообразователи: грамицидин, аламетицин. Регистрация транспорта веществ: изотопный метод, оптический метод, регистрация АТФазной активности, токи через плоскую мембрану со встроенным переносчиком, пэтч-клэмп техника.

Диффузия низкомолекулярных соединений через мембраны. Коэффициент проницаемости и скорость диффузии. Пассивный и активный транспорт веществ через мембраны. Классификация переносчиков, каналов и насосов. Ионный состав цитоплазмы клеток и внутренней среды организма. Трансмембранный потенциал и причины его возникновения. Разделение зарядов на мембране. Уравнение Нернста и Доннановское равновесие.

Первично-активный транспорт. Классификация транспортных АТФаз, их характерные свойства, внутриклеточная локализация, функции.

АТФазы Р-типа. Доменная организация и эволюция АТФаз P-типа. Общие представления о реакционном цикле АТФаз Р-типа.

Р1А и Р1В АТФазы. Распространение, особенности организации и выполняемые функции. Болезнь Вильсона-Коновалова.

Р2А АТФазы. Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) и ее изоформы. Реакционный цикл Са-АТФазы. Структура молекулы Са-АТФазы и конформационные изменения трансмембранного и цитоплазматического доменов молекулы фермента в процессе функционирования. Особенности кинетики Са-АТФазы. Олигомерная организация фермента. Белки-регуляторы Са-насоса фосфоламбан и сарколипин. Са-АТФаза секреторный путей (SPCA). Болезни человека, связанные с нарушением работы Са-АТФаз.

Р2В АТФазы. Са-АТФаза плазматических мембран и особенности её регуляции. Болезни человека, связанные с нарушением работы Са-АТФаз.

Р2С АТФазы. Na,K-АТФаза как представитель гетеродимерных АТФаз Р-типа. Открытие Na,K-АТФазы и ее идентификация как Na-насоса. Структура Na,K-АТФазы: субъединицы, их упаковка в мембране. Изоформы α- и β-субъединиц Na,K-АТФазы, их распространение и функции. Белки семейства FXYD и γ-субъединица Na,K-АТФазы. Нуклеотид-связывающий, фосфорилирующий, активаторный и трансмембранные домены Na,K-АТФазы. Третичная и четвертичная структура Na,K-АТФазы. Конформационные переходы в молекуле Na,K-АТФазы.

Функции Na,K-насоса в различных тканях: поддержание потенциала покоя и потенциала действия, транспорт сахаров и аминокислот, Na/Са- и Na/Н-антипортеры. Положительный инотропный эффект. Участие Na,K-насоса и других транспортеров в поддержании внутриклеточного рН. Участие Na,K-насоса в трансэпителиальном транспорте ионов и малых молекул. Роль Na,K-насоса в регуляции объема клетки. Na,K-АТФаза как рецептор для стероидных гормонов. Сигнальные пути, запускаемые эндогенными уабаин-подобными соединениями.

Системы, обеспечивающие секрецию соляной кислоты париетальными клетками в желудке. Структура Н,К-АТФазы, механизмы активации секреции соляной кислоты. Блокаторы Н2-рецепторов и их действие на секрецию. Семейство необратимых ингибиторов Н,К-АТФазы, механизм их действия на протонный насос. Сравнение свойств различных ингибиторов и их эффектов на Н,К-АТФазу.

Р3 АТФазы. Н-АТФаза растений, ее роль в поглощении солей корнями растений, регуляция активности за счет аутоингибиторного домена.

Р4 и Р5 АТФазы. Особенности молекулярной организации и выполняемые функции.

АТФазы V-типа: молекулярная организация и функционирование в сравнении с АТФазами F-типа. Локализация АТФаз V-типа во внутриклеточных мембранах (эндосомы и лизосомы) и в плазматической мембране клеток животных. Роль в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте, в проникновении в клетку бактерий и вирусов, в процессинге секретируемых белков и обратном транспорте в синаптосомах. Функции АТФаз V-типа в плазматической мембране остеокластов, макрофагов, интеркалярных клетках почечного эпителия и сенсорных клетках кортиевого органа, в процессе метастазирования опухолей. Регуляция активности АТФаз V-типа и роль протеинкиназ в этом процессе.

АВС-суперсемейство АТФаз и множественная устойчивость к лекарствам. АВС-АТФазы прокариот и эукариот. MDR1 человека, его структура и механизм работы. Структура генов представителей семейства АВС. Бактериальные флоппазы и пермеазы. Участие периплазматических субстрат-связывающих белков в работе пермеаз. TolC – бактериальный белок, обеспечивающий перенос различных соединений через периплазматическое пространство. Представители суперсемейства АВС, выполняющие неканонические функции (CFTR и SUR), особенности их организации и функционирования. Муковисцидоз.

Ионные каналы, их классификация, особенности структуры. Ионные радиусы и размеры пор ионных каналов. Ионная селективность и механизм работы селективных фильтров. Селективный фильтр, пора и калитка ионных каналов. Принципы работы калитки. Моделирование гидрофильных и гидрофобных калиток в мембранах («нанопоры»). Представители каналов с гидрофобными и гидрофильными калитками.

Лиганд-управляемые ионные каналы, их основные классы. Семейство «cys-loop»-каналов. Ацетилхолиновый рецептор: особенности структуры и функционирования. Хлорные каналы (глициновые рецепторы). Глутаматные рецепторы. Пуринорецепторы.

Потенциал-чувствительные ионные каналы. Особенности структурной организации потенциал-чувствительных К+-, Na+- и Са2+-каналов. Методы регистрации одиночных каналов. Параметры работы ионных каналов, определяемые в электрофизиологических экспериментах. Потенциал действия. К+-канал дрозофилы Shaker и особенности его работы. Понятие об ион-селективном фильтре канала и принципе его работы. Ион-селективные фильтры К+-каналов. Калитка (ворота) канала и управление ее работой. Конформационные переходы и управление работой калитки. Работа «сенсора напряжения» потенциал-чувствительных каналов.

Каналы, управляемые внутриклеточными сигналами. Участие цГМФ-активируемых каналов в фоторецепции. Предполагаемая структура цГМФ-управляемого канала. Участие цАМФ-активируемых Са-каналов и Са-активируемых Сl-каналов в работе обонятельных рецепторов. Участие РКА-регулируемых К-каналов во вкусовой рецепции.

SOC-каналы. Каналы, управляемые метаболитами липидного обмена. Участие TRP/TRPL-каналов в работе фоторецепторов насекомых. TRP-каналы млекопитающих. SOC и белки Orai и STIM.

Роль кальция как вторичного посредника в разных типах клеток и Са-зависимые регуляторные пути. Потенциал-чувствительные Са-каналы плазматической мембраны (дигидропиридиновые рецепторы), их типы и принципы классификации. Роль в электромеханическом сопряжении.

Внутриклеточные Са-каналы. Са-каналы (рианодиновые рецепторы): молекулярная организация и особенности регуляции. Белки «соединительных ножек» и рианодиновые рецепторы: идентификация и очистка. Структура рианодинового рецептора. Изоформы рианодинового рецептора, экспрессирующиеся в разных тканях. Активаторы и ингибиторы рианодиновых рецепторов. Особенности структурной организации триад в скелетных мышцах и диад в миокарде.

Взаимодействие рианодиновых и дигидропиридиновых рецепторов. Белки-регуляторы рианодиновых рецепторов. Механизм электромеханического сропряжения в скелетной и сердечной мышцах. Циклическая АДФ-рибоза как основной активатор Са-каналов в гладких мышцах и немышечных тканях. Регуляция сердечной изоформы рианодинового рецептора протеинкиназой А и сердечная недостаточность. Злокачественная гипертермия и Central Core Desease. Нагревательный орган рыб, участие Са-каналов и Са-АТФазы ретикулума в термогенезе.

Рецепторы инозитолтрисфосфата. Фосфатидилинозитол как предшественник вторичных посредников. Структура IP3-рецепторов. Функциональные домены IP3-рецепторов. Сходство и различие IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Регуляция IP3-рецепторов кальмодулином. Белок IRBIТ и другие белки, взаимодействующие с IP3-рецепторами. Белок Homer и формирование кластеров рецепторов плазматических мембран и внутриклеточных органелл. «Са-осцилляторы» и совместная работа IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Внутриклеточные посредники cADPR и NAADP.

Двупоровые каналы ТРС и их участие во внутриклеточной сигнализации.

Принципы пассивного и вторично-активного переноса веществ через мембраны. Переносчики суперсемейства MFS, особенности их структуры и механизм функционирования. Способы анализа аминокислотной последовательности мембранных белков и предсказания их вторичной структуры. Структура переносчика лактозы LacY и особенности его функционирования. Участие белков суперсемейства MFS в лекарственной устойчивости бактерий.

Переносчик глюкозы GLUT1, его структура и основные кинетические свойства. Анализ олигомерной организации мембранных белков и способы исследования их расположения в мембране (Cys-сканирующий мутагенез). Амфипатические α-спирали и формирование гидрофильных полостей в мембране. Семейство переносчиков GLUT-HMIT, распространение, кинетические характеристики, функции в разных тканях, особенности структуры (sugar/polyol transporter signature). Переносчики SGLT и транспорт глюкозы через эпителий в тонком кишечнике и почках. Переносчики семейства SWEET.

Заболевания, связанные с нарушением работы переносчиков глюкозы, и способы их коррекции. Нарушение поглощения глюкозы и галактозы в кишечнике. Конвульсивные состояния новорожденных и синдром De Vivo. Синдром Фанкони-Бискела. Механизм стимуляции инсулином поглощения глюкозы в скелетных мышцах, сердце, жировой ткани и диабет II типа. АТФ-управляемые К-каналы в поджелудочной железе и инсулинопатии.

Фосфатидилинозитол как предшественник ряда вторичных посредников. IP3-киназа. Два пути стимуляции инсулином встраивания везикул, содержащих переносчик GLUT4, в плазматическую мембрану.

Антипортеры и симпортеры. Na/Ca-обменник, его структура и физиологическая роль. Участие НСО3/Сl-антипортера (белок АЕ1, белок полосы III) в транспорте СО2 эритроцитами. Зависимость активности основных мембранных переносчиков, регулирующих внутриклеточный рН, от значения рН цитоплазмы. Участие ионных насосов, антипортеров и каналов в секреции соляной кислоты париетальными клетками желудочных желез. Участие антипортеров и каналов в накоплении солей и сахарозы вакуолями растительных клеток. Аквапорины и глицеропорины. Доказательства существования аквапоринов. Структуры воды и водородные связи. Молекулярная структура канала. Аквопорин как канал без калитки. свойства канала, обеспечивающие проведение воды, но не ионов (включая Н+): селективный фильтр, электростатическое отталкивание Н+, образование водородных связей с каналом. Разнообразие аквапоринов человека, аквапорины прокариот и растений. Заболевания человека, связанные с мутациями в аквапоринах (наследственная катаракта, несахарный диабет, сердечная недостаточность, ишемические поражения и водянка мозга). Аквапорины и транспорт металлоидов.

Список рекомендуемой литературы:

  1. 1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. Garland Science. 2002.
  2. 2. Arge P., Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 72-78.
  3. 3. Baumann O, Walz B. The blowfly salivary gland - a model system for analyzing the regulation of plasma membrane V-ATPase. J Insect Physiol. 2012 Apr;58(4):450-458.
  4. 4. Borgnia M., Nielsen S., Engel A., Arge P. Cellular and molecular biology of aquaporin water channels. Annu. Rev. Biochem. 1999. v. 68, pp. 425-458.
  5. 5. Bozoky Z, Krzeminski M, Chong PA, Forman-Kay JD. Structural changes of CFTR R region upon phosphorylation: a plastic platform for intramolecular and
  6. intermolecular interactions. FEBS J. 2013 Sep;280(18):4407-4416.
  7. 6. Brown G.K. Glucose transporters: structure, function and consequences of deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 2000. v. 23, pp. 237-246.
  8. 7. Cancela M.J. Specific Ca2+ signaling evoked by cholecystokinin and acethylcholine: the roles of NAADP, cADPR, and IP3. Ann. Rev. Physiol. 2001. v. 63, pp. 99-117.
  9. 8. Carterall W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. v. 16, p. 521-555.
  10. 9. Day RE, Kitchen P, Owen DS, Bland C, Marshall L, Conner AC, Bill RM, Conner MT. Human aquaporins: regulators of transcellular water flow. Biochim Biophys Acta. 2014 May;1840(5):1492-1506.
  11. 10. Donowitz M, Ming Tse C, Fuster D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na⁺/H⁺ exchangers. Mol Aspects Med. 2013 Apr-Jun;34(2-3):236-251.
  12. 11. Chang G. Multidrug resistance ABC transporters. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 102-105.
  13. 12. Flores-Soto ME, Chaparro-Huerta V, Escoto-Delgadillo M, Vazquez-Valls E, González-Castañeda RE, Beas-Zarate C. Structure and function of NMDA-type glutamate receptor subunits. Neurologia. 2012 Jun;27(5):301-310.
  14. 13. Gonzalez M.E., Carrasco L. Viroporins. FEBS Lett. 2003. v. 552, pp. 28-34.
  15. 14. Guse AH. Calcium mobilizing second messengers derived from NAD. Biochim Biophys Acta. 2015 Sep;1854(9):1132-1137.
  16. 15. Hardie R.C. Regulation of TRP channels via lipid second messengers. Ann. Rev. Physiol. 2003. v. 65, pp. 735-759.
  17. 16. Hruz P.W., Mueckler M.M. Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter. Molec. Membr. Biol. 2001. v. 18, pp. 183-193.
  18. 17. Lodish H., Berk A., Zipurski S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. Molecular Cell Biology. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2001.
  19. 18. Lopina O.D. Na,K-ATPase: structure, mechanism, and regulation. Membr. Cell Biol. 2000. v. 13, pp. 721-744.
  20. 19. MacKinnon R.M. Potassium channels. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 62-65.
  21. 20. MacLennan D.H. Ca2+ signaling and muscle disease. Eur. J. Biochem. 2000. v. 267, pp. 5291-5297.
  22. 21. Matulef K., Zagotta W.N. Cyclic nucleotide gated ion channels. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. v. 19, pp. 23-44.
  23. 22. Mikoshiba K. IP3 receptor/Ca2+ channel: from discovery to new signaling concepts. J Neurochem. 2007 Sep;102(5):1426-46.
  24. 23. Moller J.V., Juul B., le Maire M. Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 1996. v. 1286, pp. 1-51.
  25. 24. Nelson D.L., Cox M.M. Leninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2005.
  26. 25. Nishi T., Forgac M. The vacuolar (H+)-ATPases – nature’s most versatile proton pumps. Nature Rev., 2002. v. 3, pp. 94-103.
  27. 26. Ogawa Y., Kurebayashi N., Murayama T. Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 1999. v. 36, pp. 27-64.
  28. 27. Patel S, Cai X. Evolution of acidic Ca²⁺ stores and their resident Ca²⁺-permeable channels. Cell Calcium. 2015 Mar;57(3):222-230.
  29. 28. Pedersen P.L. Transport ATPases in biology systems and relationship to human disease: a brief overview. J. Bioenerg. Biomembr. 2002. v. 34, pp. 327-332.
  30. 29. Perland E, Fredriksson R. Classification Systems of Secondary Active Transporters. Trends Pharmacol Sci. 2017 Mar;38(3):305-315.
  31. 30. Pouliquin P, Dulhunty AF. Homer and the ryanodine receptor. Eur Biophys J. 2009 Dec;39(1):91-102
  32. 31. Procko E, O'Mara ML, Bennett WF, Tieleman DP, Gaudet R. The mechanism of ABC transporters: general lessons from structural and functional studies of an antigenic peptide transporter. FASEB J. 2009 May;23(5):1287-1302.
  33. 32. Quistgaard EM, Löw C, Guettou F, Nordlund P. Understanding transport by the major facilitator superfamily (MFS): structures pave the way. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Feb;17(2):123-132.
  34. 33. Rahman T, Taylor CW. Dynamic regulation of IP3 receptor clustering and activity by IP3. Channels (Austin). 2009 Jul-Aug;3(4):226-232.
  35. 34. Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 17-36.
  36. 35. Tao Y, Cheung LS, Li S, Eom JS, Chen LQ, Xu Y, Perry K, Frommer WB, Feng L. Structure of a eukaryotic SWEET transporter in a homotrimeric complex. Nature. 2015 Nov 12;527(7577):259-263.
  37. 36. Theodoulou F.L. Plant ABC transporters. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 79-103.
  38. 37. Thomas U. Modulation of synaptic signaling complexes by Homer protein. J. Neurochem. 2002. v. 81, pp. 407-413.
  39. 38. Toyoshima C., Inesi G. Structural basis of ion pumping by Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 2004. v. 73, pp. 269-292.
  40. 39. Urwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS Lett. 2003. v. 555, pp. 91-95.
  41. 40. Wood I.S., Trayhurm P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded families of sugar transport proteins. Br. J. Nutr. 2003. v. 89, pp. 3-9.
  42. 41. Yan N. Structural Biology of the Major Facilitator Superfamily Transporters. Annu Rev Biophys. 2015;44:257-83
  43. 42. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-АТФазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1389-1400.
  44. 43. Лопина О.Д., Рубцов А.М. Н,К-АТФаза и регуляция секреции НСl слизистой оболочкой желудка. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1235-1242.
  45. 44. Рубцов А.М. Молекулярные механизмы регуляции активности Са-каналов сарокоплазматического ретикулума, утомление мышц и феномен Северина. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1401-1414.
  46. 45. Рубцов А.М., Батрукова М.А. Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1091-1105.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 17.04.2018