Cпециальные методы спектроскопии

Лектор и составитель курса - профессор, д.б.н. Ф.Ф. Литвин

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса

Явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Параметры спектров ЭПР (g - фактор, ширина линии, электрон-ядерные взаимодействия и сверхтонкая структура спектров ЭПР). Свободнорадикальные состояния в световых стадиях фотосинтеза, радикалы белков. Ознакомление с устройством основных блоков спектрометра РЗ 1306 (лаборатория молекулярной спектроскопии Института фундаментальных проблем биологии РАН). Техника измерения спектров. Регистрация спектров ЭПР стабильного радикала ДФПГ и радикалов в тканях растений.

Масс-спектрометрия в биологических исследованиях

Конструкция и принципы работы современного масс-спектрометра на примере LCQ Deca XP (ThermoFinnigan, USA) (Институт белка РАН). Характер получаемой информации исследуемых объектов и аналитические возможности метода масс-спектрометрии. Применение масс-спектрометрии в молекулярной биологии и биохимии. Исследование особенностей химического строения органических молекул методом их фрагментации (МСn). Практическое определение состава смесей продуктов гидролиза белков и идентификация белков; расчет молекулярного веса белков по их масс-спектрам.

Ядерный магнитный резонанс высокого разрешения

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Типы ЯМР-высокого разрешения, низкого разрешения и метод ЯМР-релаксации Спектроскопия высокого разрешения, основы теории, кинетический и квантово-механический подход. Гиромагнитное отношение, спиновой момент ядра, прецессия в постоянном магнитном поле, Ларморова частота. Условие резонанса при действии высокочастотного поля, химический сдвиг. Квантово-механическое описание ядерного магнитного резонанса, правило отбора (Δ m = ±1). Заселенность спиновых состояний, спин-решеночная релаксация, вектор намагниченности. Импульсные методы, сигналы спада свободной индукции. Измерение протонного спектра ЯМР высокого разрешения этанола, использование дейтерированного растворителя. Наблюдение химического сдвига и мультиплетного расщепления, константа спин-спинового взаимодействия. Времена спин-решеточной и спин-спиновой релаксации. Исследование временных характеристик. Некоторые методики ЯМР, применяемые для изучения молекул белков, их конформаций, структуры и динамики молекул в растворе. Исследования межбелковых взаимодействий. Одномерный (1D), двумерный (2 D) и многомерный спектр ЯМР. Преобразованный спектр ЯМР. Импульсная ЯМР Фурье спектроскопия. Применение упрощенного метода Фурье-преобразования для непосредственного получения спектров из сигналов спада свободной индукции. Определение числа и положения атомов водорода в молекуле. Ознакомление с современным ЯМР-спектрометром “Avance-600” (Bruker) и криогенной техникой (в лаборатории ЯМР-исследований Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН). Получение релаксационных спектров. Определение времен релаксации для простых соединений.

Спектры поглощения белков и нуклеиновых кислот

Общие закономерности ультрафиолетового (УФ)-поглощения белков и нуклеиновых кислот. Спектральные параметры аминокислот, тонкая структура спектра. Изменение спектров аминокислот под влиянием внешних факторов (рН среды, протонирование ионогенных групп). Ультрафиолетовые спектры поглощения белков. Особенности структуры спектров белков по сравнению со спектрами смеси ароматических аминокислот, входящих в их состав. Методы расчета вклада светорассеяния в измеряемое поглощение белков. Влияние рН на спектр поглощения рибонуклеазы. Оценка вклада тирозина, доступного внешнему воздействию (рН), методом дифференциальной спектрофотометрии. Расчет для белков (трипсина и рибонуклеазы) коэффициентов экстинкции и сечения поглощения аминокислотных остатков из экспериментальных данных. Расчет содержания хромофоров в молекуле белка. УФ поглощение нуклеиновых кислот, хромофоры. Расчет гиперхромного эффекта при переходе от двухспиральных структур ДНК к односпиральной. Вклад взаимодействия оснований в гиперхромный эффект. Тепловая денатурация и ренатурация ДНК. Кривые плавления ДНК. Определение концентрации ДНК по спектрам поглощения.

Линейный дихроизм и ориентация молекул в биологических объектах

Основы спектрополяриметрии. Линейный дихроизм, дихроичное отношение и степень дихроизма. Метод расчета ориентации хромофоров молекул в биологических препаратах (мембраны, комплексы). Способы ориентации бактериальных и пигмент-белковых комплексов (методом линейной деформации). Устройство и принцип работы двухлучевого регистрирующего спектрофотометра с приставкой для спектрополяриметрических измерений. Расчет дихроичности и степени дихроизма. Вычисление углов ориентации хромофоров молекулы бактериохлорофилла в мембранах пурпурных бактерий.

Инфракрасная Фурье-спектроскопия биологических объектов

Фурье-спектроскопия в инфракрасной области. Принцип метода, интерферометр Майкельсона, Фурье преобразование. Преимущества Фурье-спектроскопии. Механизм формирования интерферограммы, разложение периодической временной функции в ряд Фурье и Фурье-анализ такого разложения. Зависимость формы интерферограммы от частоты излучения, ширины спектральных линий и соотношения амплитуд. Современный Фурье-спектрометр (Equinox-55) и работа на нем. Алгоритм измерения спектров. Инфракрасные колебательно-вращательные спектры простых молекул PQR-структура. Расчет вращательной постоянной, момента инерции и длины межатомных связей по спектрам низкого и высокого разрешения колебательных спектров и их интерпретация, минорные полосы, горячие линии и обертоны, расчет равновесной частоты колебаний и постоянной ангармоничности молекул (СО2, Н2О, ацетон, бензол, спирты и др.). Расчет и построение общей схемы колебательных и вращательных переходов в молекуле СО2. Расчет величины вращательной постоянной, момента инерции и длины межатомных связей. Идентификация веществ и анализ структуры с использованием компьютерного банка данных, внесение информации в банк.

Методы исследования флуоресценции биологических объектов в видимой и ультрафиолетовой области спектра

Качественный и количественный анализ веществ по спектрам флуоресценции и спектрам возбуждения флуоресценции. Аппаратура для измерения спектров флуоресценции, ее возбуждения и производных спектров при комнатной и низкой (770К) температурах. Сопоставление спектров флуоресценции пигментов в растворе и в клетке. Тушение флуоресценции. Исследование эффекта тушения флуоресценции в зависимости от концентрации тушителя. Индукция флуоресценции фотосинтезирующих организмов (микроводоросли) и исследование механизма фотосинтеза. Фёрстеровский перенос энергии электронного возбуждения (FRET). Диполь-дипольное взаимодействие донора и акцептора энергии индуктивно-резонансный механизм, интергал перекрывания спектров – зависимость от расстояния между донором и акцептором. Критический Фёрстеровский радиус. Роль ориентационного фактора. Феноменология явления – сенсибилизированная флуоресценция. Расчет по экспериментальным данным квантового выхода переноса энергии, константы переноса и расстояния между донором и акцептором. Метод флуоресцентных зондов. Определение константы связывания и концентрации мест связывания зонда в мембране. Флуоресцентныые индикаторы рН. Использование зеленого флуоресцирующего белка (JEP) и цветных белков для внутриклеточного измерения рН, концентрации ионов. Принцип дифференциальной флуоресцентной спектроскопии (исследование алкогольдегидрогеназной реакции).

Спектрофлуориметрическое исследование ароматических аминокислот и белков

Спектры флуоресценции и ее возбуждение ароматических аминокислот и белков. Производная спектрофлуориметрия. Спектральный комплекс с двумя монохроматорами и работа на нем. Компьютерная обработка результатов измерений Форма одиночной спектральной полосы и ее производных при обычных и низких (-196ОС) температурах. Измерение спектров флуоресценции свободных аминокислот и белков. Исследование тонкой структуры спектров флуоресценции белков методом измерения первой, второй и четвертой производных. Сопоставление спектров белков со спектрами свободных аминокислот. Влияние денатурации на спектр флуоресценции, оценка вклада тирозиновой и триптофановой компонент во флуоресценцию белка. Разложение спектров флуоресценции многокомпонентных систем (белки, смеси аминокислот) на составляющие и оценка доли поглощения и флуоресценции составляющих в суммарном спектре с использованием данных производной спектроскопии. Поляризация флуоресценции, анизотропия флуоресценции. Уравнение Перрена. Корелляционные спектры флуоресценции. Получение информации о диффузии, величине и форме ориентации молекул в растворе и клетке, переносе энергии между молекулами.

Часть занятий по курсу (чтение лекций и ознакомление с современными методами и аппаратурой, используемой в биологических исследованиях) проводятся преподавателями на летней практике по спектроскопии в г. Пущино.

Литература

Основная:

  1. 0рир Дж. Электричество, волны, квантовая физика. В кн.: Физика. М.: Мир, 1981, т.2.
  2. Эткинс П. Физическая химия. М.: Мир, 1980, т.1, 2.
  3. Фрайфельдер Д. Физическая химия. М.: Мир, 1980.
  4. Campbell L.D., Dwek R.A. Biological Spectroscopy of Oxford.
  5. Banwell C.N., McCash Fundamentals of Molecular Spectroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), 4изд. (Berrshire England).

Дополнительная:

  1. Грибов Л.А. Введение в молекулярную спектроскопию. М.: Наука, 1976.
  2. Балтроп Дж., Койл Дж. Возбужденные состояния в органической химии. М.: Мир, 1978
  3. Michael Hollas J. Modern Spectroscopy. Second Edition. John Wily and Sons? 1995.
  4. McHale J.L. Molecular Spectroscopy. Prentice Hall N 9, 1999.
  5. Крауфорд Ф. Волны в кн. Берклеевский курс физики. М.:Наука, 1976, т.III.
  6. Вихман Э. Квантовая физика, в кн. Берклеевский курс физики. М.:Наука, 1976, T.IV.


2008 г.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010