Программа спецкурса "Энзимология"

Лектор - профессор Н.К. Наградова

Часть 1. Общие принципы структурной организации белков и молекулярные механизмы их сворачивания в функционально активную конформацию.

Элементы вторичной и супервторичной структуры: α-спирали, комбинации β-тяжей, петли. Современные представления о классификации петель и их роли в сворачивании и в проявлении функциональных свойств белков. Типы комбинаций элементов вторичной структуры для образования различных мотивов. Домены; их основные характеристики. Взаимосвязь между пространственной структурой белка и его биологической активностью. Рассмотрение на примере отдельных ферментов, объединенных в 6 основных классов согласно их функциональным характеристикам.

Актуальность проблемы расшифровки «второй половины генетического кода», определяющей зависимость третичной структуры белка от его аминокислотной последовательности. Парадокс Левинталя и современные представления о механизмах сворачивания белков. Небольшие различия в величинах свободной энергии между свернутым и развернутым состояниями белка как необходимая предпосылка реализации его функциональной активности. Обоснование концепции, согласно которой одна и та же аминокислотная последовательность может формировать множественные пространственные структуры с неодинаковыми функциями. Значение конформационного разнообразия в эволюции пространственной структуры и функции белков.

Сворачивание белков как механизм внутриклеточной сигнализации. Белки, присутствующие в клетке в частично развернутом состоянии.(«естественно-развернутые белки»). Высокая пластичность таких белков, определяющая многообразие принимаемых ими конформаций и их роль в процессах внутриклеточной сигнализации. Множественные циклы локального сворачивания-разворачивания как важная особенность функционирования таких белков в клетке.

Участие междоменных взаимодействий в сворачивании белков. Является ли домен самостоятельной единицей сворачивания в составе мономерной молекулы белка? Независимое сворачивание отдельных доменов с последующим установлением контактов между ними либо взаимодействие между структурами, формирующими отдельные домены, начинающееся уже на первых этапах сворачивания. Междоменные взаимодействия при сворачивании олигомеров. Пространственный обмен доменами. Взаимосвязь между механизмом олигомеризации белка путем обмена доменами и механизмом сворачивания данного белка.Структурные предпосылки, определяющие способность полипептидной цепи к сворачиванию через стадию обмена доменами. Взаимосвязь этого процесса с образованием агрегатов и амилоидных структур (цистатин, прионы и др.)

Пространственный обмен доменами как элемент механизмов внутриклеточной регуляции. Примеры обмена доменами в физиологических условиях, приводящего к изменению функциональных свойств белка. Превращение рибонуклеазы семенной жидкости, не обладающей аллостерическими свойствами, в аллостерическую форму через обратимое разворачивание белка и его новое сворачивание при участии обмена доменами. Пространственный обмен доменами как механизм «конформационного переключения» в регуляторных белках. Обмен доменами в процессе сворачивания супрессора циклин-зависимой киназы l (pl3sucl) в димерную структуру; взаимосвязь этого явления с передачей аллостерических сигналов между разными участками макромолекулы.

Особенности сворачивания белков во внутриклеточном окружении. Макромолекулярный кроудинг. Два способа реализации эффективного сворачивания белков in vivo - котрансяционное сворачивание и участие белков-шаперонов. Котрансляционное сворачивание мультидоменных белков.Паузы в трансляции. Проявления котрансляционного сворачивания в клетках прокариот и эукариот. Котрансляционное сворачивание белков эндоплазматического ретикулума. Механизмы, обеспечивающие контроль качества сворачивания . Шапероны-лектиновой природы кальнексин и кальретикулин.

Участие ферментов фолдаз в сворачивании белков. Протеин-дисульфидизомераза; ее формы в клетках прокариот и эукариот. Реакция цис/транс. изомеризации пролинов как скорость-лимитирующая стадия образования нативной структуры ряда белков и как механизм перехода между их разными конформационными состояниями. Примеры, иллюстрирующие роль цис/транс изомеризациии пролинов как молекулярного «переключателя», контролирующего функцию белка в клетке. Пептидил-пролил-цис/транс-изомерзза и ее формы. Триггер-фактор; его структура, локализация на рибосоме и функциональная роль.

Шапероны группы Hsp70 и их биологические функции. Структурные характеристики Hsp70 и его ко-шаперонов (Hsp44 и Hsp22) в клетках прокариот и в разных компартментах эукариотических клеток. Структура и функции трех доменов молекулы Hsp 70. Структура ко-шаперонов бактериальных клеток - DnaJ и GrpE и механизм их действия в комплексах с бактериальным шапероном DnaK. GrpE как молекулярный термосенсор, способный «запирать» белок-мишень в прочном комплексе с DnaK. Каталитический цикл системы DnaK-DnaJ-GrpE в процессе спонтанного сворачивания белка.

Функции Hsp70 и его ко-шаперонов, выходящие за рамки их роли в сворачивании белков. Участие модульных доменов (J-домена, TRP-домена и Bag-домена) во взаимодействии Hsp70 с различными белками с образованием комплексов, определяющих дальнейшую судьбу полипептида, связанного с шапероном. Роль Hsp70 в посттрансляционном переносе белков через мембраны внутриклеточных органелл. Механизмы транспорта белков через внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий. Митохондриальный Hsp70 как молекулярный мотор транслокации. Модели, описывающие механизм его функционирования. Участие Hsp70 в процессах, направляющих связанные с ним белки на путь деградации.

Шаперон Hsp90 как специализированный инструмент для сворачивания и активации определенных групп белков эукариотической клетки. Особенности белков-«клиентов» шаперона Hsp90. Мультидоменная структура Hsp90. Механизм димеризции N-концевых доменов и функциональная роль этого процесса. Каталитический цикл шаперона Hsp90 и его отличие от цикла шаперона Hsp70. Характеристика взаимодействия разных типов ко-шаперонов с Hsp90 и механизмов их регуляторного влияния. Hsp90 как «шаперон передачи внутриклеточных сигналов».Участие Hsp90 в транспорте белков во внутреннюю митохондриальную мембрану. Роль этого шаперона в направлении белков на деградацию.

Шаперонины и их роль в сворачивании белков. Шаперонины группы I. Структура молекулы GroEL и его ко-шаперонина GroES. Реакционный цикл системы GroEL/ GroES. Конформационные изменения, приводящие к частичному разворачиванию белка-субстрата до его попадания в полость шаперонина. Экспериментальные доказательства «форсированного разворачивания». Роль повторных циклов сворачивания-разворачивания в механизме действия шаперонина. Концепция «сворачивание путем форсированного разворачивания». Рассмотрение концепции, предусматривающей влияние микроокружения закрытой полости GroEL на скорость сворачивания белка. Аллостерические эффекты, обеспечивающие согласованное функционирование цис- и транс- тороидов молекулы GroEL . Структурные основы температуро-зависимой регуляции работы шаперонина. GroEL как универсальный инструмент сворачивания, обладающий умеренной эффективностью.

Шаперонины группы II. Их структурные отличия от шаперонинов группы I и связанные с этим особенности функциональных циклов. Шаперонин цитозоля эукариотической клетки ССТ. Характеристика его взаимодействия с субстратами. Особенности движения доменов при переходе от открытого к закрытому состоянию. Рассмотрение механизма сворачивания актина и тубулина в полости ССТ. Роль последовательных конформационных изменений, передаваемых внутри кольца, образуемого разными субъединицам, в приобретении белком-субстратом нативного состояния. ССТ как молекулярная машина, приспособленная для решения трудных задач сворачивания белков.

Префолдин как новый тип молекулярных шаперонов, обеспечивающий возможность ко-трансляционного сворачивания определенной группы белков архебактерий и цитозоля эукариотической клетки. Основные характеристики структурной организации молекулы префолдина и их роль в выполнении его функции. Префолдин как фактор, обеспечивающий правильную ориентацию белка-субстрата в комплексе с ССТ. Характеристика комплекса, включающего префолдин, актин и ССТ. Модель ко-трансляционного сворачивания белков в цитозоле эукариотической клетки.

Стерические шапероны. Определение понятия. Группа внутримолекулярных стерических шаперонов. Рассмотрение их свойств на примере про-домена субтилизина. Стадии сворачивания про-субтилизина и роль про-домена в приобретении нативной конформации фермента. Про-домен как фолдаза, влияющая на скорость-лимитирующую стадию сворачивания белка. Влияние структуры про-домена на характер сворачивания субтилизина. Рассмотрение концепции, согласно которой путь сворачивания белка может быть изменен под влиянием внешнего фактора. Специфичные к липазам бактериальные шапероны (Lif) как представители группы стерических шаперонов, не являющихся внутримолекулярными. Их локализация в клетке,структура и каталитические свойства.

Роль шаперонов в образовании олигомерной структуры белков. Участие системы GroEL/GroES в сворачивании гетероолигомерных комплексов в нативную конформацию. Роль «повторного отжигания» в отборе субъединиц, образующих правильные контакты на уровне четвертичной структуры. Функция периплазматического шаперона бактерий PapD в формировании олигомеров, образующих нитевидные структуры-пили. Стабилизация области межсубъединичного контакта образованием комплекса с комплементарной структурой молекулы шаперона. Экспериментальное обоснование модели, согласно которой взаимодействие с шапероном останавливает сворачивание субъединицы-пилина, сохраняя энергию сворачивания для использования в процессе сборки олигомера.

Разворачивание и деградация белков в клетке. Роль разворачивания белков в реализации жизненно-важных внутриклеточных процессов. Источники энергии для разворачивания. Особенности разворачивания белков при их транслокации через мембраны митохондрий; роль N-концевой сигнальной последовательности. Молекулярные шапероны семейства HsplOO (ААА+). Структура и механизм действия шаперонов, осуществляющих АТР-зависимую дезагрегацию белков. Принципы структурной организации и функционирования молекулярных машин, способных разворачивать стабильные свернутые белки, несущие соответствующую метку, и осуществлять их деградацию (ClpAP, ClpXP прокариот и протеасомы эукариот). Механизмы, направляющие белки на деградацию. Котрансляционная и посттрансляционная модификации, участие шаперонов Hsp70 и Hsp90, а также вспомогательных белков.

Разворачивание белков в составе протеасомы как важный элемент процесса их деградации. Структура прокариотической и эукариотической потеасомы. Вероятная роль убиквитиновой цепочки в определении механизма разворачивания. Структура «шаперонного кольца», осуществляющего разворачивание, и взаимосвязь циклов его функционирования с регуляцией открывания входа в канал, образуемый кольцами протеолитически активных субъединиц.

Литература

  1. Белки и пептиды (ред. В.Т. Иванов и В.М. Липкин) т.1. М., Наука, 1995.
  2. А.В. Финкелынтейн и О.Б. Птицын Физика белка. Москва 2002.
  3. Н.К. Наградова Как построены ферменты. Энциклопедия СОВРЕМЕННОЕ ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ. Молекулярные основы биологических процессов (ред. В.Н. Сойфер) т. 8, с.137-148. М., Магистр-Пресс, 2000.
  4. Н.К. Наградова Пространственный обмен доменами в гомоолигомерных белках и его функциональное значение. Биохимия т. 67, с.1013-1025, 2002.
  5. Н.К. Наградова Сворачивание белков в клетке. О механизмах его ускорения. Биохимия т. 69, с. 1021-1037, 2004.
  6. A.M. Lesk, С. Chotia How different amino acid sequences determine similar protein structures: the structure and evolutionary dynamics of the globins. J. Mol. Biol., v. 136, p. 225-270,1980.
  7. S.E. Radford Protein folding: progress made and promises ahead. TIBS, v. 25, p. 611-618,2000.
  8. J. Rumbley, L.Hoang,, L Mayne , S.W. Englander An amino acid code for protein folding. PNAS, v. 98, p.105-112, 2001.
  9. CM. Dobson, P.A. Evans, S.E. Radford Understanding protein folding: the lysozyme story so far. TIBS, v. 19, p. 31-37, 1994.
  10. F.U.Hartl, M. Hayer-Hartl Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, v. 295, p. 1852-1858,2002.
  11. A. Richardson, S.J. Landry, C. Georgopoulos The ins and outs of a molecular chaperone machine. TIBS, v.23, p. 138-143, 1998.
  12. J.D. Wang, J.S. Weissman Thinking outside the box: new insights into the mechanism of GroEL-mediated protein folding. Nature Struct. Biol. V. 6, p.597-600, 1999.
  13. U.P. Shinde, J.J. Liu, M. Inouye Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. Nature, v. 389, p. 520- 522, 1997.
  14. S. Normark Anfinsen comes out of the cage during assembly of the bacterial pilus. PNAS, v. 97, p. 7670-7672, 2000.

Часть 2. Ферменты, структурные основы и молекулярные механизмы катализа и регуляции активности.

Молекулярные механизмы конформационной подвижности белков и ее функциональное значение. Общая характеристика типов подвижности белковой молекулы (беспорядочные флуктуации относительно одного равновесного состояния и кооперативные движения, включающие переход от одной равновесной конформации к другой). Понятие о методах, позволяющих исследовать динамику единичной молекулы белка в реальном времени.. Мультидоменная организация ферментов. Основные типы движения доменов. Обоснование концепции, согласно которой «открытое» и «закрытое» конформационные состояния белка находятся в равновесии, будучи разделены небольшим энергетическим барьером. Связь подвижности доменов с функцией ферментов; примеры.

Принципы ферментативного катализа. Отличия ферментативного катализа от неферментативного. Рассмотрение энергетического профиля односубстратной некатализируемой химической реакции. Основное и переходное состояния. Энергия активации. Соотношение между величиной энергии активации и константой скорости реакции. Энергетический профиль простейшей односубстратной ферментативной реакции. Образование фермент-субстратного комплекса и его роль в катализе. Рассмотрение природы сил, вовлеченных в связывание фермента с субстратом, на разных стадиях катализа.

Химические механизмы стабилизации переходных состояний ферментативных реакций. Экспериментальные подходы к оценке вклада взаимодействий между разными функциональными группами фермента и субстрата в стабилизацию основного и переходного состояний. Рассмотрение, на примере тирозил-тРНК-синтетазы, каталитического превращения, реализуемого в основном за счет изменения энергии связывания субстрата с ферментом по ходу реакции. Использование направленного мутагенеза, позволяющего оценить вклад разных функциональных групп фермента в прочность взаимодействия с субстратом по всему профилю реакции, как независимого подхода для характеристики природы конформационных изменений, сопровождающих катализ.

Типы катализа используемые ферментами. Общие кислоты и основания в молекулах ферментов. Зависимость величин их рКа от характера микроокружения и важность этого фактора в катализе. Примеры. Каталитический механизм аспартатных протеиназ. Пепсин: структурные основы активации при отщеплении про-пептида и механизм катализа. Структура и каталитический механизм карбоксипептидазы А. Структура и каталитический механизм триозофосфатизомеразы. Факторы, обеспечивающие оптимальную эффективность работы этого фермента и его высокую специфичность.

Ковалентный катализ. Общая характеристика. Нуклеофильный катализ. Каталитический механизм сериновых протеаз. Химотрипсин: механизм активации и характеристика отдельных стадий катализа. Роль низкобарьерных водородных связей в эффективности катализа. Каталитический механизм цистеиновых протеаз и альдегиддегидрогеназ. Нуклеофильный катализ в действии фосфатаз и фосфокиназ. Электрофильный катализ; его основные черты. Сочетание элементов электрофильного и нуклеофильного катализа. Катализ с образованием оснований Шиффа. Электрофильный катализ с участием молекул кофермента: пиридоксаль-5-фосфата и тиаминпирофосфата. Катализ ионами металлов. Примеры.

Структура и каталитические свойства NAD(P)-зависимых ферментов. Принципы организации нуклеотид-связывающего домена; его особенности у семейства альдегидцегидрогеназ. Конформация NAD+ в растворе и в комплексе с дегидрогеназами. Понятие о комплексах с переносом заряда. Специфичность ферментов по отношению к NAD+ и к NADP+ и ее структурные предпосылки. Стереоспецифичность переноса гидрид-иона. Структура и каталитический механизм лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Общие закономерности, определяющие взаимосвязь структуры и функциональных свойств этих ферментов. Использование генно-инженерных подходов для изменения специфичности NAD+-зависимых дегидрогеназ по отношению к коэнзиму и субстрату.

Механизмы регуляции активности ферментов. Прямое влияние на активный центр (действие конкурентных ингибиторов, ковалентная модификация). Механизм активации ц-АМР-зависимой протеинкиназы. Аллостерические эффекты. Роль олигомерной структуры; понятие о межсубъединичной кооперативности.Типы локализации аллостерических лигандов. Регуляторные домены. Основные черты моделей, описывающих кооперативное поведение ферментов. Примеры, иллюстрирующие структурные основы и молекулярные механизмы аллостерической регуляции активности аспартаттранскарбамоилазы, гликогенфосфорилазы, фруктозо-1,6-бисфосфатазы, пируваткиназы. Роль регуляторных доменов в регуляции функционирования src тирозинкиназы. Понятие о полифункциональных ферментах. Общая характеристика полифункциональных ферментов, катализирующих противоположно направленные реакции. Молекулярные механизмы, обеспечивающие координацию работы разных активных центров в составе 6-фосфофрукто-2-киназы / фруктозо-2,6-бисфосфатазы.

Полифункциональные ферменты и полиферментные комплексы, катализирующие последовательные реакции метаболических путей. Структурные основы туннелирования интермедиата между активными центрами, формируемыми разными доменами или субъединицами (триптофансинтаза, глюкозамин-6-фосфатсинтаза). Направленное движение интермедиата по «шоссе», проходящему по поверхности молекулы тимидилатсинтазы / дигидрофолатредуктазы, и соединяющему ее активные центры. Молекулярные механизмы согласования работы активных центров, соединенных туннелем или «шоссе».

Каталитические антитела (абзимы) как примитивные ферменты. Теоретические предпосылки создания абзимов и их практическая реализация. Экспериментальные подходы к получению антител, катализирующих разные реакции. Примеры, иллюстрирующие сходство общих принципов функционирования абзимов и ферментов. Методы усовершенствования функциональных свойств абзимов. Генно-инженерные подходы к получению каталитических антител. Практическое использование абзимов в химии, биотехнологии и медицине.

Литература

  1. Э. Фершт Структура и механизм действия ферментов. Мир, М., 1980.
  2. М. Диксон, Э. Уэбб Ферменты, т.2. Мир, М., 1982. 2. Д. Мецлер, Биохимия, т.2. Мир, М., 1980.
  3. М. Бендер, Р. Бергерон, М. Комияма Биоорганическая химия ферментативного катализа. Мир, М., 1987.
  4. Н.К. Наградова Как работают ферменты. Энциклопедия СОВРЕМЕННОЕ ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ, Молекулярные основы биологических процессов (ред. В.Н. Сойфер) т. 8, с.158-168. М., Магистр-Пресс, 2000.
  5. Н.К. Наградова Олигомерная структура ферментов и ее функциональная роль. Там же, с.149-157.
  6. Н.К. Наградова Каталитические антитела. Там же, с. 174-181.
  7. Н.Б. Ливанова, Б.А. Корнилаев Структура, регуляция и денатурация мышечной гликогенфосфорилазы b. Биохимия, т. 61, с. 2005-2017, 1996.
  8. A.R. Fersht, R.J. Leatherbarrow, T.N. Wells Binding energy and catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. TIBS, v.l 1, p. 321-325, 1986.
  9. A.R. Clarke, T. Atkinson, J.J. Holbrook From analysis to synthesis: new ligand binding sites on the lactate dehydrogenase framework. Part I. TIBS, v. 14, p. 101-105, 1989.
  10. A.R. Clarke, T. Atkinson, J.J. Holbrook From analysis to synthesis: new ligand binding sites on the lactate dehydrogenase framework. Part II. TIBS, v.14, p.145-148, 1989.
  11. J.R. Knowles Enzyme catalysis: not different, just better. Nature, v. 350, p. 121-124, 1991.
  12. A. Mattevi, M. Bolognesi, G. Valentini The allosteric regulation of pyruvate kinase. FEBS Lett, v. 389, p.15-19, 1996.
  13. P.Pan, E. Woehl, M.F. Dunn Protein architecture, dynamics and allostery in tryptophan synthase channeling. TIBS, v. 22, p. 22-27, 1997.
  14. E. W. Miles, S.Rhee, D.R. Davies The molecular basis of substrate channeling. J.Biol. Chem., v. 274, p. 12193-12196, 1999.
  15. P.G. Schultz The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts. Science, v.240, p. 426-443, 1988.

2004 г.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010